Membran Yetişkin farelerin ventromedial Hipotalamus Nöronlar Potansiyel Boya Görüntüleme Glikoz Algılama Çalışması için

Published: November 27th, 2013

DOI:

10.3791/50861

Reema P. Vazirani¹, Xavier Fioramonti², Vanessa H. Routh¹

¹Department of Pharmacology and Physiology, Rutgers New Jersey Medical School, ²Center for Taste and Feeding Behavior, Universite de Bourgogne

Yetişkin-yaşlı farelerin tek nöronların aktivitesi belirli beyin bölgelerinde nöronları dissociating ve floresan membran potansiyeli boya görüntüleme kullanılarak incelenebilir. Glikoz değişikliklere test yanıtlar olarak, bu teknik, yetişkin ventromedial hipotalamus nöronları glikoz duyarlılığını belirlemek için kullanılabilir.

Nöronal aktivite çalışmaları nedeniyle sık sık artan bağ dokusu ile ilgili teknik zorluklar kemirgenler yaş en az 2 ay nöronları kullanılarak gerçekleştirildi ve yaş ile oluşan nöronal canlılığı azalmıştır. Burada, yetişkin yaşlı farelerin sağlıklı hipotalamik nöronların ayrışma için bir metodoloji tarif eder. Yetişkin-yaşlı farelerin nöronların çalışma yeteneği daha geç bir yaşta tezahür ve bazı çalışmalar için daha fazla gelişimsel doğru olabilir hastalık modellerinin kullanımına izin verir. Tek bir nöron çalışma elektrofizyoloji kullanarak karşıt olarak ayrışmış nöron Floresan Görüntüleme, nöronların nüfusu aktivitesini incelemek için kullanılabilir. Istenen nöronal tipi, hipotalamik glikoz algılama nöronlar için nadir olan bir heterojen popülasyonu nöronal okuyan bu özellikle yararlıdır. Biz cha onların yanıtları incelemek için yetişkin ventromedial hipotalamik nöronların membran potansiyeli boya görüntüleme kullanılmaktadırhücre dışı glükoz nges. Glikoz algılama nöronlar enerji dengesi düzenlenmesinde merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır. Yetişkin kemirgenler glikoz algılamayı çalışma yeteneği işlevsiz enerji dengesi (örn.. Obezite) yaşla birlikte artış ile ilişkili hastalıkların baskın beri özellikle yararlıdır.

Beyin nöroendokrin ve otonom sinir sistemleri ile enerji homeostazisini düzenler. Ventromedial hypothalamus (VMH), ventromedial çekirdeği (VMN) ve kavisli çekirdek (ARC) oluşan, enerji homeostazının düzenlenmesinde merkezi için önemlidir. İhtisas glikoz algılama nöronlar, VMH içinde, nöron aktivitesi ve periferik glukoz homeostazını ^1. bağlantı. Glikoz heyecanlı (GE) glikoz (GI) nöronlar dışı glikoz arttıkça onların aktivitesini azaltmak inhibe ederken nöronlar artırmak; nöronların algılama glikoz iki türü vardır. VMH glukoz algılama nöronlar genellikle elektrofizyoloji veya kalsiyum / zar potansiyeli duyarlı boya görüntüleme kullanılarak incelenmiştir. ....

1.. Hayvanlar

Tüm prosedürler New Jersey Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Tıp Üniversitesi'nde Komitesi ve Diş Hekimliği tarafından onaylanmıştır.
Ev grup erkek C57BL / 6, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık programına fareler ve su ve gıda ad libitum erişim sağlar. 4-5 aylıkken kurban. Farelerin Ötenazi anestezi cerrahi düzlemi ve ötenazi ikinci bir formu (örneğin, diyafram üzerinden göğüs boşluğuna nüfuz kesi) kullanılarak gerçekleştirilmişt.......

Hipotalamik uzak diğer alanlardan VMH kesin diseksiyon tutarlı sonuçlar elde etmek için önemlidir. Diğer alanların dahil hesaplanan depolarize nöronların% değişen VMH nöron popülasyonu seyreltik olabilir. Ayrıca, glikoz algılama nöronlar gibi VMH glikoz algılama nöronlardan işlevsel ve mekanistik farklılıklar olabilir yan hipotalamus, hipotalamik ve diğer bölgelerde belirlenmiştir. 1 Uygun diseksiyon için doğru anatomik konumlarını göstermektedir Şekil. Yuk.......

Yetişkin farelerden alınan nöronların aktivitesini incelemek mümkün olmanın anahtarı sağlıklı nöronlar ayırmak için yeteneğidir. Yetişkin farelerden hipotalamus nöronları ayrışması, çocuk farelerden nöronların kıyasla protokolde çeşitli önemli adımlardan daha zordur. Biz, bir dizi yolla, bu sorunun üstesinden gelmiştir. 500 um kalınlığında Beyin dilimleri yapmak küçük farelerden alınan beyin dokusu için kullanılan olağan 250-350 um dilimleri ile karşılaştırıldığında nör.......

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

....

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal-A Medium (Custom)	Invitrogen	0050128DJ	custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom)	BrainBits		custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)	Invitrogen	15140	other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm)	Millipore		other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips	Warner	#1 25mm round
18 mm Glass coverslips	Warner	#1 18mm round
GlutaMAX	Invitrogen	35050
B27 minus insulin (50x)	Invitrogen	0050129SA
Razor blade	VWR	55411
Vibratome & cooling chamber	Vibratome	Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades	Polysciences	22370	injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension	Worthington	LS003124
BSA, suitable for cell culture	Sigma		other vendor acceptable
DNAse, for cell culture	Invitrogen		other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm	Bellco Glass	2090-00608
Membrane Potential Dye (blue)	Molecular Devices	R8042
In-line heater	Warner	SF-28
Syringe pumps	WPI	sp100i	other vendor acceptable
Closed chamber	Warner	RC-43C
Polyethylene tubing	Warner	PE-90
Metamorph	Molecular Devices		alternate image analysis software acceptable
Microscope	Olympus	BX61 WI	used with 10X objective
Camera	Photometrics	Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set	Chroma	41007a
Illumination System	Sutter Instruments	Lambda DG-4

Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).