<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов Cut открыть Вазелин Gap Напряжение-зажим Техника С флуорометрии

Summary

Подход Вазелин разрыв отключения открытым используется для получения низких шумовых записи ионных и стробирования токов от потенциал-зависимых ионных каналов, выраженных в Xenopus ооциты с высоким разрешением быстрой кинетики канала. С небольшим изменением, зажим напряжение флюометрия может быть соединен с протоколом ооцитов вырезом открыт.

Abstract

Ооцит Вазелин разрыв отключение открытой (CoVG) техника зажим напряжения позволяет для анализа электрофизиологических и кинетических свойств гетерологичных ионных каналов в ооцитов. Записи от установки бортового открытым особенно полезны для решения малых токов величина литниковые, быстрого ионной активации текущий и дезактивацию. Основные преимущества над двухэлектродной зажима напряжения (TEVC) техники включают повышенную скорость зажим, улучшение соотношения сигнал-шум, и способность модулировать внутриклеточной и внеклеточной среде.

Здесь мы используем человеческий канал сердечная натрия (HNA _V 1.5), выраженную в Xenopus ооцитах, чтобы продемонстрировать настройку бортового открытым и протокол, а также изменения, которые необходимы, чтобы добавить зажим напряжение возможность флуорометрии.

Свойства быстрых активирующих ионных каналов, таких как HNA _V 1,5, не могут быть полностью решены около комнатной температуре с использованием TEVC, в whicч полнота ооцита мембраны зажимается, что делает контроль напряжения трудно. Однако, в технике вырезом открыт, выделение только небольшой части клеточной мембраны позволяет быстро зажима, необходимого, чтобы точно записать быструю кинетику, предотвращая канала краткое изложение, связанное с методами патч зажима.

В сочетании с техникой CoVG, ионных каналов кинетики и электрофизиологические свойства могут быть дополнительно анализировали с помощью напряжения зажим флуорометрии, где движение белок отслеживается с помощью цистеина конъюгации внеклеточно, применяемых флуорофоров, вставка генетически кодируемых флуоресцирующих белков, или включения неприродных аминокислот в интересующей области ^1. Это дополнительные данные дает кинетическую информацию о потенциал-зависимых конформационных перестроек белка через изменения в микросреды, окружающей флуоресцентные молекулы.

Introduction

Специализированный методы напряжение зажимные разрешить запись ионных токов при контролируемых мембранных потенциалов. Широко используется двухэлектродной зажим напряжения (TEVC) и методы патч зажим обеспечивают надежную электрофизиологические информацию о свойствах многих ионных каналов. Тем не менее, оба этих метода имеют свои недостатки, которые препятствуют приобретению надежных данных для быстрых напряжения натриевых каналов и других каналов быстро активирующих в мембранах, таких как те, из Xenopus ооциты. В Безания и Стефани лаборатории следовательно разработана методика Вазелин разрыв зажим напряжения бортового открытым (CoVG) для ооцитов ^2.

Protocol

1. Начальная настройка оборудования

1. Поместите сцену и микроэлектродной манипулятор в системе вибрации изоляции (например таблицы воздуха) с окружающей клетки Фарадея для предотвращения электрического и механического шума.
2. Припой шесть Ag / AgCl гранул к длинам шестидюймовыми от 24 AWG провода. Для одного из этих длин (для подключения к P1), соединение в второй проволоки, чтобы сформировать "Y". На концах каждого провода припаять золотую BNC штифт, который входит с усилителем.
3. Подключите пять Ag / AgCl гранулы спаянные до 24 AWG провода к headstage Ванна / Guard (P1, P2, CC, GS1 и GS2). Подключите «я» Ag / AgCl окатышей на "I" h....

Discussion

Ооцит Вазелин техника напряжение на промежутке зажим отключение открытой позволяет быстро разрешения данных, низкий уровень шума, возможность постоянного контроля за внутренним решением и внешнего состава раствора, и стабильные записи над относительно длинных протоколов ^19. Эт.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.