Nem Måling af diffusionskoefficienter af EGFP-tagget plasmamembranproteiner Brug k-Space Billede korrelationsspektroskopi

Lateral spredning og opdeling af plasmamembranproteiner er stramt reguleret i celler og dermed vil studere disse processer afslører nye indsigter til plasmamembranprotein funktion og regulering. For nylig, k-Space Billede korrelationsspektroskopi (VIF) ¹ blev udviklet for at muliggøre rutinemæssige målinger af diffusionskoefficienter direkte fra billeder af fluorescens mærkede plasma membranproteiner, der undgås systematiske afvigelser indført ved sonde fotofysik. Selv om det teoretiske grundlag for analysen er kompleks, kan fremgangsmåden gennemføres ved nonexperts ved hjælp af en frit tilgængelig kode til at måle diffusionskoefficienterne af proteiner. VIF'er beregner tidsmæssig sammenhæng funktion fra en fluorescensmikroskopi billedstak efter Fourier transformation af hvert billede til gensidig (k-) rum. Efterfølgende cirkulær gennemsnitsberegning, naturlige logaritme transformere og lineær passer til korrelationsfunktionen giver den diffusionskoefficient. Detpapir giver en trin-for-trin guide til billedet analyse og måling af diffusionskoefficienter via VIF'erne.

Først foretages en høj rammehastighed billedsekvens for fluorescensmærket plasmamembranprotein erhvervet ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Derefter er en region af interesse (ROI) at undgå intracellulære organeller, flytte blærer eller udstående membran regioner valgt. Stak ROI importeres til en frit tilgængelig kode og flere definerede parametre (se metode afsnit) er indstillet for VIF'er analyse. Programmet genererer derefter en "hældning af skråninger" plot fra k-rums tid korrelationsfunktioner, og diffusionskoefficienten beregnes ud fra hældningen af ​​plottet. Nedenfor er en trin-for-trin VIF'er procedure til at måle diffusionskoefficient en membran protein ved renal vand kanal aquaporin-3 tagget med EGFP som en kanonisk eksempel.