Facile mesure de coefficients de diffusion de EGFP-marqués plasma protéines membranaires en utilisant K-image de l'espace spectroscopie de corrélation

Diffusion latérale et la compartimentation des protéines de la membrane plasmique sont strictement réglementées dans les cellules et donc, l'étude de ces processus va révéler de nouvelles perspectives à plasma fonction de la protéine de la membrane et de la réglementation. Récemment, k-image de l'espace spectroscopie par corrélation (CCI) ¹ a été développé pour permettre des mesures de routine de coefficients de diffusion directement à partir des images des protéines de la membrane plasmique marquées par fluorescence, qui ont évité les biais systématiques introduites par photophysique de la sonde. Bien que la base théorique pour l'analyse est complexe, le procédé peut être mis en oeuvre par des non experts en utilisant un code librement disponible pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines. CIEk calcule une fonction de corrélation temporelle d'une image de microscopie à fluorescence pile après transformation de Fourier de chaque image pour réciproque (k-) espace. Par la suite, une moyenne circulaire, logarithme naturel transformée linéaire et correspond à la fonction de corrélation donne le coefficient de diffusion. Cedocument fournit un guide étape par étape pour l'analyse d'image et la mesure des coefficients de diffusion via CIEk.

D'abord, une image d'une séquence de protéines de membrane de plasma marqué par fluorescence de cadence élevée est acquise en utilisant un microscope à fluorescence. Puis, une région d'intérêt (ROI) en évitant organites intracellulaires, les vésicules se déplaçant ou en saillie régions de la membrane est sélectionné. La pile de retour sur investissement est importé dans un code librement disponible et plusieurs paramètres définis (voir la section Méthode) sont définis pour l'analyse des CCI. Le programme génère alors une «pente des pentes« complot des fonctions de corrélation de temps k-espace, et le coefficient de diffusion est calculée à partir de la pente de la courbe. Voici une procédure étape par étape CIEk pour mesurer le coefficient de diffusion d'une protéine de membrane à l'aide du rénale canal d'eau aquaporine-3 marqués avec EGFP comme un exemple canonique.