Easy Måling av diffusjonskoeffisienter av EGFP-merket plasma membran Proteiner Bruke k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi

Lateral spredning og compartmentalization av plasma membran proteiner er strengt regulert i celler og dermed vil studere disse prosessene avsløre nye innsikter til plasma membran protein funksjon og regulering. Nylig, k-Space Bilde korrelasjon spektroskopi (kICS) ¹ ble utviklet for å muliggjøre rutinemålinger av diffusjonskoeffisienter direkte fra bilder av fluorescently merkede plasma membran proteiner, som unngikk systematiske skjevheter introdusert av probe photophysics. Selv om det teoretiske grunnlag for analysen er komplekse, kan fremgangsmåten gjennomføres ved nonexperts ved hjelp av en fritt tilgjengelig kode for å måle diffusjonskoeffisienter i proteiner. kICS beregner en tid korrelasjon funksjon fra en fluorescens mikrosbildestakk etter Fourier transformasjon av hvert bilde til gjensidige (k-) plass. Deretter sirkulær gjennomsnitt, naturlig logaritme transformere og lineær passer til korrelasjonen funksjonen gir den diffusjonskoeffisienten. DetteArtikkelen gir en steg-for-steg guide til bildeanalyse og måling av diffusjonskoeffisienter via kICS.

Først blir en høy bildefrekvens bildesekvens fra et fluorescensmerkede plasmamembranprotein ervervet ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Så, er en region av interesse (ROI) unngå intracellulære organeller, flytting vesikler eller utstående membran regioner valgt. Den avkastningen stabelen importeres til en fritt tilgjengelig kode og flere definerte parametere (se metode kapittel) er satt for kICS analyse. Programmet genererer deretter en "skråningen av bakkene" plottet fra k-space tid korrelasjonsfunksjoner, og spredningen koeffisienten beregnes fra skråningen av tomten. Nedenfor er en steg-for-steg kICS prosedyre for å måle spredningen koeffisient av en membran protein ved hjelp av nedsatt vann kanal aquaporin-3 tagget med EGFP som en kanonisk eksempel.