Fácil medição de Difusão Coeficiente de EGFP-tag Plasma Proteínas de Membrana Usando k-Space espectroscopia de correlação de Imagem

Difusão lateral e compartimentalização de proteínas da membrana plasmática são fortemente regulados em células e, assim, estudar esses processos irão revelar novas perspectivas para a função da proteína da membrana plasmática e regulação. Recentemente, k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) ¹ foi desenvolvido para permitir medições de rotina de coeficientes de difusão diretamente a partir de imagens de proteínas da membrana plasmática marcados fluorescente, que evitaram desvios sistemáticos introduzidos pelo fotofísica sonda. Embora a base teórica para a análise é complexo, o método pode ser implementado por não-especialistas, utilizando um código livremente disponível para medir os coeficientes de difusão de proteínas. CCI calcula uma função de correlação de tempo a partir de uma imagem Pilha de microscopia de fluorescência após a transformação de Fourier de cada imagem para (k-) espaço recíproco. Subsequentemente, transformar média circular, logaritmo natural e linear encaixa para a função de correlação obtém-se o coeficiente de difusão. Estedocumento fornece um guia passo-a-passo para a análise de imagem e medição de coeficientes de difusão via CCI.

Primeiro, uma sequência de imagens de alta taxa de quadros de uma proteína da membrana plasmática fluorescente etiquetado é adquirido através de um microscópio de fluorescência. Em seguida, uma região de interesse (ROI) evitando organelas intracelulares, vesículas em movimento ou salientes regiões da membrana é selecionado. A pilha de ROI é importado para um código disponível gratuitamente e vários parâmetros definidos (ver secção Method) são definidos para análise CCI. O programa então gera uma "inclinação das encostas" complô das funções de correlação tempo k-espaço, eo coeficiente de difusão é calculado a partir da inclinação da trama. Abaixo está um procedimento passo-a-passo CCI para medir o coeficiente de difusão de uma proteína de membrana usando o canal de água aquaporina renal-3 marcado com EGFP como um exemplo canônico.