Легко Измерение коэффициентов диффузии в EGFP-меченых белков плазматической мембраны Использование К-пространство изображения корреляционной спектроскопии

Боковая диффузия и компартментализация плазменных мембранных белков жестко регулируется в клетках и, таким образом, изучая эти процессы покажет новое понимание плазмы функции белка мембраны и регулирования. Недавно, к-пространственной корреляции изображения спектроскопия (Kics) ¹ был разработан для того, чтобы обычные измерения коэффициентов диффузии непосредственно из образов флуоресцентно меченых белков плазматической мембраны, что избежать систематических ошибок, вносимых зонда фотофизики. Хотя теоретической основой для анализа является сложным, способ может быть реализован с использованием неспециалистов свободном доступе код для измерения коэффициентов диффузии белков. Kics вычисляет время корреляционной функции из стека изображений флуоресцентной микроскопии после преобразования Фурье каждого изображения на обратной (к-) пространстве. Впоследствии, круговая усреднение, натуральный логарифм преобразования и линейная подходит для корреляционной функции дает коэффициент диффузии. Этодокумент содержит шаг за шагом руководство по анализу изображений и измерения коэффициентов диффузии через Kics.

Во-первых, высокая частота кадров последовательность образ дневно с надписью плазмы мембранного белка приобретается с помощью флуоресцентного микроскопа. Затем выбирается область интереса (ROI) избегая внутриклеточных органелл, двигаясь пузырьки или выступающие мембранные регионы. Стек ROI импортируется в свободном доступе кода и несколько определенных параметров (см. раздел Method) установлены для анализа Kics. Затем программа создает "крутизны склонов" заговора от К-пространстве времени корреляционных функций, а коэффициент диффузии рассчитывается по наклону участка. Ниже шаг за шагом Kics процедура измерения коэффициента диффузии мембранных белков с помощью почечной воды канала аквапорин-3 с меткой EGFP как канонический пример.