Lätt Mätning av diffusionskoefficienter av EGFP-taggade Plasma membranproteiner Använda k-Space Bild korrelationsspektroskopi

Lateral diffusion och uppdelning av plasmamembranproteiner är hårt reglerad i celler och på så sätt kommer att studera dessa processer visar nya insikter till plasmamembranprotein funktion och reglering. Nyligen, k-Space Bild Korrelation spektroskopi (KI-grupper) ¹ utvecklades för att möjliggöra rutinmässiga mätningar av diffusionskoefficienter direkt från bilder av fluorescerande taggade plasmamembranproteiner, som undvek systematiska fel som införs genom sondfotofysik. Även om den teoretiska grunden för analysen är komplex, kan förfarandet genomföras genom nonexperts med hjälp av en fritt tillgänglig kod för att mäta diffusionskoefficienter i proteiner. KI-grupperna beräknar en tidskorrelationsfunktion från en fluorescensmikroskopi bildstapel efter Fourier transformation av varje bild till ömsesidig (k-) utrymme. Därefter cirkulär medelvärdes, naturliga logaritmen omvandla och linjär passar till korrelationsfunktionen ger diffusionskoefficienten. Dettapapper ger en steg-för-steg guide till bildanalys och mätning av diffusionskoefficienter via KI-grupperna.

För det första är en hög bildhastighet bildsekvens av en fluorescensmärkt plasmamembranprotein förvärvas med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Då är en region av intresse (ROI) undvikande intracellulära organeller, flytta blåsor eller utskjutande membranregioner som valts. ROI stack importeras till en fritt tillgänglig kod och flera definierade parametrar (se metod avsnittet) är inställda för KI-grupper analys. Programmet genererar sedan en "lutning på backen" plot från k-space tidskorrelationsfunktioner, och diffusionskoefficienten beräknas från lutningen på tomten. Nedan följer en steg-för-steg KICS förfarande för att mäta diffusionskoefficienten för ett membranprotein med användning av renalt vatten kanal aquaporin-3 etiketten EGFP som en kanonisk exempel.