K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Yanal difüzyon ve plazma membran proteinlerinin kompartmentalizasyonunun sıkı hücrelerinde düzenlenir ve bu nedenle, bu süreçleri inceleyerek plazma membran proteini fonksiyonu ve regülasyonu için yeni anlayışlar ortaya çıkaracaktır. Son zamanlarda, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) ¹ doğrudan prob fotofizikten tarafından tanıtıldı sistematik önyargıları kaçınılması floresan etiketli plazma zarı proteinlerinin görüntüleri, gelen difüzyon katsayılarının rutin ölçümler sağlamak için geliştirilmiştir. Analiz için teorik temel karmaşık olsa da, bu yöntem proteinlerin difüzyon katsayıları ölçmek için bir kodu kullanarak serbestçe kullanılabilir nonexperts ile uygulanabilir. kICS karşılıklı (k-) alan her görüntünün Fourier dönüşümünden sonra bir floresan mikroskopi görüntü yığınından bir zaman korelasyon işlevi hesaplar. Daha sonra, dairesel ortalama, doğal logaritma dönüşümü ve doğrusal verir korelasyon fonksiyonuna difüzyon katsayısı uyuyor. BuKağıt kICS üzerinden görüntü analizi ve difüzyon katsayılarının ölçümü için bir adım-adım kılavuz sağlar.

İlk olarak, bir floresan etiketli plazma zar proteini yüksek çerçeve hızlı görüntü dizisi, bir floresans mikroskobu kullanılarak elde edilir. Daha sonra, ilgi (ROI) membran bölgeleri, hücre içi organelleri kaçınarak veziküllerini hareketli veya çıkıntılı bir bölge seçilir. ROI yığını bir serbestçe kullanılabilir koduna ithal edilir ve birkaç tanımlanmış parametreler (Yöntem bölümüne bakınız) kICS analiz için ayarlanır. Program daha sonra k-uzay zaman korelasyon fonksiyonlarından komplo bir "yamaçlarında yamaç" oluşturur ve difüzyon katsayısı arsa eğiminden hesaplanır. Aşağıda bir örnek olarak, bir kanonik EGFP ile etiketlendi renal su kanalı aquaporin-3 ile, bir membran proteini difüzyon katsayısı ölçmek için bir adım adım kICS işlemdir.