البروتيوميات الكمي عن طريق انتقاصية Dimethylation لمستقر النظائر وصفها

Published: July 1st, 2014

DOI:

10.3791/51416

Andrew C. Tolonen^1,2,3, Wilhelm Haas⁴

¹CEA, DSV, IG, Genoscope, ²CNRS-UMR8030, Évry, France, ³Université d'Évry Val d'Essonne, ⁴Massachusetts General Hospital Cancer Center

وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات بواسطة dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) هي استراتيجية غير مكلفة السريع لدقيقة الشامل القائم على البروتينات الطيف الكمي. نحن هنا لشرح طريقة قوية لإعداد وتحليل مخاليط البروتين باستخدام نهج ريدي التي يمكن تطبيقها على ما يقرب من أي نوع العينة.

وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات بواسطة dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) هو وسيلة لقياس بدقة الفروق بين البروتين التعبير العينات باستخدام مطياف الكتلة. يتم تنفيذ وسم ريدي باستخدام إما العادية (الضوء) أو بالديوتيريوم (الثقيلة) أشكال الفورمالديهايد والصوديوم cyanoborohydride إضافة إلى اثنين من مجموعات الميثيل إلى كل أمين الحرة. نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول قوية لوضع العلامات وريدي مقارنة كمية من خليط من البروتين المعقدة. يتم هضمها عينات البروتين للمقارنة في الببتيدات، وصفت لتنفيذ إما خفيفة أو ثقيلة الميثيل به، مختلطة، وشارك في تحليل من قبل LC-MS/MS. وكميا وفرة البروتين النسبية بمقارنة المناطق الذروة ايون اللوني من الإصدارات الثقيلة والخفيفة وصفت من الببتيد المكونة المستخرجة من كامل أطياف MS. الطريقة الموضحة هنا يشمل إعداد عينة من عكس المرحلة استخراج المرحلة الصلبة، ووضع العلامات ريدي على عمود من الببتيدات، الببتيد تجزئة من قبل القس درجة الحموضة الأساسيةersed المرحلة (BPRP) اللوني، وStageTip تنقية الببتيد. نحن نناقش مزايا وقيود وضع العلامات ريدي فيما يتعلق بأساليب أخرى لإدماج النظائر مستقرة. نسلط الضوء تطبيقات جديدة باستخدام الوسم ريدي كوسيلة سريعة وغير مكلفة، ودقيقة للمقارنة بين تركيزات البروتين في أي نوع تقريبا من العينة.

قياس الاختلافات تركيز العديد من البروتينات المعقدة بين العينات هو التحدي الرئيسي في البروتينات. على نحو متزايد، ويجري ذلك عن طريق وضع العلامات البروتينات في كل عينة مع العلامات النظائر المختلفة، والجمع بين العينات، واستخدام مطياف الكتلة لقياس الاختلافات التركيز. توجد عدة طرق لوضع العلامات النظائر مستقرة من البروتينات والببتيدات ¹⁵ N وضع العلامات ¹ و ² SILAC إدخال تسميات النظائر عملية الأيض في الجسم الحي، في حين ICAT ^{3، 4} iTRAQ، والحد من dimethylation ⁵ إضافة علامات النظائر مستقرة بعد استخراج البروتين والهضم. بين هذه الأساليب، dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ....

ملاحظة: هذه الطريقة تم وصفها سابقا ^12.

1. عزل بروتين

إعداد 1 ملغ من البروتين الخلوية من قبل خلايا lysing، ويفضل عن طريق الطرق الفيزيائية مثل الصحافة الفرنسية، وحبة الضرب، أو صوتنة. تجنب بوساطة .......

قمنا بتقييم دقة، والدقة، واستنساخ لوضع العلامات ريدي باستخدام خميرة الخباز وكلوستريديوم phytofermentans لست] خلية كاملة. نحن كميا لأول مرة ريدي كفاءة وسم مزيج من C. phytofermentans لست] البروتين من السليلوز (المسمى الثقيلة، H) والجلوكوز (التسمية ضوء، L) الثقافات. عندما تمت ت.......

عدة نقاط تجعل وضع العلامات النظائر مستقرة الببتيدات باستخدام dimethylation الاختزالية (وضع العلامات ريدي) وسيلة جذابة للالبروتيوميات الكمية: الكواشف غير مكلفة وضع العلامات (تكلف الكواشف أقل من 1 دولار لكل عينة)، ومعدل رد فعل سريع (~ 10 دقيقة)، وغياب المنتجات الجانبية، وارتفا.......

We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.

....

Name	Company	Catalog Number	Comments
trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips

Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
Hsu, J. -. L., Huang, S. -. Y., Chow, N. -. H., Chen, S. -. H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).