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Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Chemistry
安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス
還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。
還元ジメチル化（ラベリングのRedi）によるペプチドの安定同位体標識を正確に質量分析を使用して試料間のタンパク質発現の差異を定量化する方法である。 REDI標識は、各フリーアミンに2個のメチル基を追加するために、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを定期的に（光）または重水素化（重）の形式のいずれかを使用して実行されます。ここでは、REDI標識および複雑なタンパク質混合物の定量的な比較のための堅牢なプロトコルを示しています。比較のためのタンパク質試料を光や重いメチルタグ、混合し、LC-MS/MSによって共同で分析のいずれかを実行するために標識されたペプチドの中に消化される。タンパク質の相対存在量は、全MSスペクトルから抽出された成分ペプチドの重鎖及び軽標識バージョンのイオンクロマトグラムのピーク面積を比較することにより定量される。ここで説明する方法は、塩基性のpH REVによる逆相固相抽出によるサンプル調製、ペプチドのオンカラムREDIラベル、ペプチド分画を含んでいるersed相（BPRP）クロマトグラフィー、およびStageTipペプチド精製。当社は、安定同位体の組み込みのための他の方法に関してREDIラベルの利点と制限について説明します。我々は、サンプルのほぼすべてのタイプの中のタンパク質の存在量を比較するために、高速で安価な、そして正確な方法としてREDIのラベリングを用いた新規のアプリケーションを強調表示します。
複雑なサンプル間の多くのタンパク質の濃度差を測定するプロテオミクスにおける中心的な課題である。ますます、このことは、異なる同位体タグを各試料中のタンパク質を標識するサンプルを結合し、濃度差を定量化するために質量分析法を用いて行われている。いくつかの方法がタンパク質およびペプチドの安定同位体標識のために存在しています。15 N標識の1やSILAC 2 ICAT 3、のiTRAQ 4、還元ジメチル化5は、タンパク質の抽出および消化後に安定同位体タグを追加する一方で、 生体内で代謝的に同位体標識を導入。これらの方法の中でも、還元ジメチル化（ラベリングのRedi）は、サンプルのほぼ任意のタイプのタンパク質濃度の違いを定量化するための安価な、再現性のある方法として人気を集めている。
REDI標識は、その後減少するシッフ塩基を形成し、ホルムアルデヒドとペプチドを反応させることを含むシアノ水素化による。この反応は、N-末端およびリジン側鎖およびmonomethylates N-末端のプロリンに遊離アミノ基をdimethylates。ここで説明するプロトコルは、重水素化ホルムアルデヒドとシアノ水素化ホウ素（ 図1）を使用して、「重い」のラベルとの天然の同位体分布とサンプル2の水素原子を有する試薬を使用した「光....
私たちは、Saccharomyces cerevisiaeを使用して正確さ、精度、およびREDIラベルの再現性を評価し、 クロストリジウムは、全細胞溶解物をphytofermentans。まず、CのミックスのRediの標識効率を定量化セルロース（重ラベル、H）とグルコース（光ラベル、L）の培養物からタンパク質溶解物をphytofermentans。 1％ペプチド偽発見率に濾過する場合、このサンプルは、98％のRed.......
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
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