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Chemistry

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

Published: July 1st, 2014

DOI:

10.3791/51416

1CEA, DSV, IG, Genoscope, 2CNRS-UMR8030, Évry, France, 3Université d'Évry Val d'Essonne, 4Massachusetts General Hospital Cancer Center

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확하게 질량 분석기를 사용하여 샘​​플 간의 단백질 발현 차이를 정량화하는 방법입니다. REDI 라벨은 각각의 유리 아민에 두 개의 메틸 그룹을 추가하기 위해 정기적 (빛) 또는 포름 알데히드와 나트륨 시아 노보로 하이드 라이드의 중수 (무거운) 양식을 사용하여 수행됩니다. 여기에서 우리는 REDI 표시와 복잡한 단백질 혼합물의 정량 비교를위한 강력한 프로토콜을 보여줍니다. 비교를 위해 단백질 시료는 빛 또는 무거운 메틸 태그, 혼합하고, LC-MS/MS 공동 분석 중 하나를 수행하는 레이블 펩타이드로 분해된다. 상대 단백질의 개체수는 전체 MS 스펙트럼에서 추출 된 성분 펩타이드의 무겁고 가벼운 표시된 버전의 이온 크로마토 그램의 피크 면적을 비교하여 정량화. 여기에서 설명하는 방법은 샘플 역상 고상 추출에 의한 제조, 펩타이드에 열 REDI 라벨, 기본 산도 회전에 의해 펩타이드 분획을 포함ersed 상 (BPRP) 크로마토 그래피 StageTip 펩티드 정제. 우리는 안정 동위 원소의 설립을위한 다른 방법에 대한 REDI 라벨의 장점과 한계에 대해 설명합니다. 우리는 샘플의 거의 모든 종류의 단백질의 개체수를 비교하는 빠르고, 저렴하고 정확한 방법으로 REDI 라벨을 사용하여 새로운 응용 프로그램을 강조 표시합니다.

복잡한 시료 사이에 많은 단백질의 농도 차이를 측정하는 것은 단백질 체학의 중심 과제이다. 점점이 서로 다른 동위 원소의 태그를 각 샘플에서 단백질을 라벨 샘플을 결합하고, 농도의 차이를 정량화하기 위해 질량 분석기를 사용하여 수행되고있다. 몇 가지 방법은 단백질과 펩타이드의 안정 동위 원소 표지 존재한다. ICAT 3, iTRAQ 4, 환원 디메틸 화 5 단백질 추출 및 소화 후 안정 동위 원소의 태그를 추가하는 반면 15 N 표시 1 SILAC 2, 생체 내에서 대사 동위 원소 라벨을 소개합니다. 이러한 방법 중에서, 환원 디메틸 화 (REDI 라벨링)는 샘플의 거의 모든 종류의 단백질 농도 차이를 정량화 할 수있는 저렴하고 재현성있는 방법으로 인기를 얻고있다.

REDI 라벨은 감소 쉬프 기반을 형성하는 포름 알데히드와 반응 펩티드를 포함노보로 하이드 라이드로. 이 반응은 N-말단 및 리신 측쇄 monomethylates 및 N-말단에 프롤린 자유 아미노기를 dimethylates. 여기에 설명 된 프로토콜은 중수 소화 포름 알데히드와 노보로 하이드 라이드 (그림 1)를 사....

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참고 :이 방법은 이전에 12를 설명했다.

1. 단백질 분리

바람직하게는 프랑스어 프레스, 구슬 박동, 또는 초음파 등의 물리적 방법에 의해, 용해하는 세포에 의해 세포 단백질의 1 밀리그램을 준비합니다. 효소 질량 분석 측정을 혼동하기 때문에 라이소자임 - 매개 세포 용해를 방지.

단백질의 2. TCA 강수량

?.......

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우리는 사카로 마이 세스 세레 비시 애를 사용하여 정확도, 정밀도 및 REDI 라벨의 재현성을 평가하고 클로 스트 리듐 속의 세균은 전체 세포 용 해물을 phytofermentans. 우리는 먼저 C의 혼합의 REDI 라벨의 효율성을 정량화 셀룰로오스 (무거운 표시, H)과 포도당 (빛 라벨, L) 문화에서 단백질 해물을 phytofermentans. 1 %의 펩타이드 거짓 발견의 속도로 여과 할 때,이 샘플은 .......

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높은 저렴한 라벨 시약 (시약은 샘플 당 1 달러 미만의 비용), 빠른 반응 속도 (~ 10 분), 부산물의 부재 : 몇 가지 점은 양적 proteomics의 매력적인 방법 환원 디메틸 화 (REDI 라벨)를 사용하여 펩티드의 안정 동위 원소 라벨링을 재현성 (도 3,도 4), 안정적인 반응 생성물, 임의의 단백질 분해 효소를 사용하는 능력 및 표지 된 펩티드의 높은 이온화 효율. 이 합성 중간에 특정 아미노산 auxotrop.......

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We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
trichloroacetic acidSigma-AldrichT9159protein precipitation
acetoneSigma-Aldrich650501protein precipitation
Sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich71736denature, reduce protein
sodium hydroxideSigma-AldrichS8045denature, reduce protein
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43816denature, reduce, alkylate protein
protease Inhibitor Complete Mini CocktailRoche4693124001denature, reduce protein
iodoacetamideSigma-AldrichI6125alkylate protein
HEPESSigma-AldrichH7523resuspend, extract, label protein
calcium chlorideSigma-AldrichC5670resuspend protein
Lysyl EndoproteaseWako Chemicals129-02541protein digestion
sequencing grade trypsinPromegaV5111protein digestion
acetic acidSigma-Aldrich320099protein digestion
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich299537Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridgesWatersWAT054960Reversed-phase peptide extraction
extraction manifoldWatersWAT200609Reversed-phase peptide extraction
acetonitrileSigma-Aldrich14261various
formaldehydeSigma-Aldrich252549“light” peptide labeling
cyanoborohydrideSigma-Aldrich71435“light” peptide labeling
deuterated formaldehydeSigma-Aldrich492620“heavy” peptide labeling
sodium cyanoborodeuterideCDN isotopesD-1797“heavy” peptide labeling
MESSigma-AldrichM3671peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)Agilent770450-902basic pH reversed-phase chromatography
formic acidSigma-Aldrich399388various
C18 Empore Disks3M14-386-3 STAGE tips
methanolSigma-Aldrich494437STAGE tips

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