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要約

嗅覚受容体活性化パターンは、臭気の同一性をコードするが、哺乳類の嗅覚受容体に対する臭気物質リガンドを同定公表されたデータの欠如は臭気符号化の総合的なモデルの開発を妨げる。このプロトコルは、嗅覚受容体リガンドおよび受容体活性化の定量化のハイスループット同定を容易にする方法が記載されている。

要約

匂い物質は、約千マウスおよび400人の受容体ファミリーは、匂い物質の数千人を認識できるように、嗅覚受容体活性化のユニークで重複パターンを作成します。臭気物質リガンドは、ヒト受容体1から11未満の6％について公表されています。データの欠如は、機能的に異種系でこれらの受容体を発現する困難さに起因する。ここでは、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、嗅覚受容体活性化のハイスループット評価に続いHana3A細胞における嗅覚受容体ファミリーの大部分を発現させる方法を記載している。このアッセイは、嗅覚受容体のパネルに対する臭気物質の（1）スクリーンパネルに使用​​することができ; （2）用量反応曲線を経由して匂い物質/受容体相互作用を確認。および（3）受容体変異体のうち、受容体活性化のレベルを比較する。サンプル·データでは、328嗅覚受容体は、臭気物質26に対してスクリーニングした。様々な応答スコアが匂い物質/受容体ペアは選択範囲だったテッドと用量反応でテスト。これらのデータは、画面が用量反応実験に合格する匂い物質/受容体ペアを濃縮するための効果的な方法、匂い物質に対する善意の応答を持っているすなわち受容体であることを示している。したがって、このハイスループットルシフェラーゼアッセイは、哺乳類の嗅覚系における臭気符号化のモデルへ嗅覚受容体に必須な工程を特徴付けるための効果的な方法である。

概要

哺乳類の嗅覚系は、匂い物質の何千もの検出および識別を可能にし、臭気刺激の膨大な数に応答する能力を持っています。嗅覚受容体（ORS）は、嗅上皮12内の嗅細胞によって発現される分子センサーである。哺乳類の匂い認識は匂い物質によるORの差動活性化を介して発生し、または遺伝子ファミリーは、およそ千マウスおよび400ヒト受容体12月16日に、広範囲に及ぶ。嗅覚ニューロンにおける異種細胞でのORの前の機能解析は、さまざまな匂い物質がユニークで認識されていることを示しますが、論理和10,17-20のアンサンブルを重ねてきた。論理和にリガンドを一致させることは嗅覚コードと嗅覚の生のモデルを構築するための不可欠なを理解するために重要です。により、異種システムでの論理和だけでなく、匂い物質と論理和の両方の多数を表現する難しさに、このデータは、Fからのほとんど存在しているield;確かに、人間の論理和未満の6％は、公表リガンド1月11日を持っている。このプロトコルは、付臭剤/ ORの相互作用を特徴づけるルシフェラーゼアッセイの使用が記載されている。このアッセイは、ORのハイスループット特性評価、匂い物質/ ORの相互作用を理解するだけでなく、臭い符号化のモデルを開発するために不可欠であるタスクを可能にします。

ORのハイスループット研究は、三つの主要な課題に直面している。まず、オッズ比は、ERに保持され、その後、プロテアソーム21,22で分解、アッセイ系23〜25内の臭気物質と相互作用するのORを防止し、異種細胞で発現。この問題は、論理和19,26,27の広範囲の安定な細胞表面発現を容易にするアクセサリータンパク質の発見によって対処した。受容体-トランスポータータンパク質1および2（RTP1および2）を促進OR刺激臭剤19に応答して細胞表面発現および活性化。この研究に基づいて、HEK293T細胞であった安定にHana3A細胞株19,27、その結果、長いRTP1（RTP1L）およびRTP2、受容体発現促進タンパク質1、およびGのαolfを発現するように改変された。また、タイプ3ムスカリン性アセチルコリン受容体（M3-R）は、細胞表面での論理和と相互作用し、臭気物質26に反応して活性化を増強する。堅牢でのHana3A細胞の結果にRTP1SとのORとM3-Rの同時トランスフェクション、一貫性があり、細胞表面27でのORの広い範囲の機能的発現。第二に、哺乳類又はレパートリーは非常に大きいです。ヒトでは、例えば、和レパートリーは味覚受容体のレパートリーを超える数々の桁であり、視覚的な受容体のレパートリーを超える数々の2桁。比較的簡単なプロトコルで、単一またはあるのクローンを作成するが、有意なアップフロントの努力は、包括的なライブラリを生成する必要がある。我々は幻の中で、波長は色に変換されることを知っているが、第3、第オーディション周波数がピッチに変換で、臭気の組織はあまりそれが困難な研究者が、臭気物質の代表的なサンプルから補間できるようにすること、理解されている。いくつかの進歩がこのフロント10,28について説明したが、嗅覚風景のマップが不完全なままになります。 ORの数百万の分子に対して、数千の物をスクリーニングすることは困難な作業です。このドメイン内のハイスループットスクリーニングは、慎重に定義のキャンペーンを必要とする。主要な残された課題は、物流とコストではなく、技術に固有の問題点のものです。異種スクリーニングが広く学術基によってリガンドを同定するために使用されていないが、民間企業が100ヒト論理和29に対するリガンドを同定するために同じ技術を使用した。残念ながら、これらのデータは、独自のまま。

ここで概説するハイスループットルシフェラーゼアッセイは、評価OR活性化するために使用される代替方法を超えるいくつかの利点を有する。責任もののネイティブ嗅細胞のSESは電気生理学およびカルシウムイメージングを用いて測定された、これらの技術は、困難なため、嗅覚ニューロンの応答特性の重複にニューロンの応答につながるまたは離れてからかっています。 、GFP標識受容体タイプ30,31にノック32,33嗅覚ニューロンをネズミアデノ経由で特定の受容体を提供するか、17,24,33は単一の受容体の種類に録音をリンクすることができます録音した後、RT-PCRを行うこと、これらの方法ではあるが低スループットと大規模スクリーニングには適していません。異種スクリーニングシステムは、よりスケーラブルであり、2つの主要な形態は、文献で発見されています。cAMP経路の記者やイノシトール三リン酸（IP3）経路の記者。匂い刺激すると、オッズ比は、サイクリックAMP（cAMP）の12の産生をもたらすシグナル伝達カスケードのGαolf伝達を活性化する。交流の制御下にホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を共トランスフェクトすることによりAMP応答エレメント（CRE）、ルシフェラーゼ産生の定量化は、OR活性化を可能にする、匂い応答の関数として測定することができる。または活性化はまた、Gα15/16またはGのα15-OLFキメラ24,25,34などのGタンパク質を共発現によりIP3経路にリンクすることができます。我々は3つの要因に基づいてここで紹介するアッセイを選択している：（1）Rhoのタグを付けた嗅覚受容体とRTP1の共発現は、細胞表面19,27の嗅覚受容体の発現が向上します。 （2）のcAMP応答性レポーター遺伝子の使用は、測定OR標準的なセカンドメッセンジャー経路を介した活性化を可能にする;および（3）アッセイは、ハイスループットスクリーニングに適している。

このハイスループットルシフェラーゼアッセイは、嗅覚の分野に貴重な様々な研究にも適用可能である。まず、論理和をとり、多数の種のための受容体活性化パターンを決定するために、単一臭気物質に対してスクリーニングすることができるecific匂い物質。このタイプの研究は、またはステロイド嗅覚アンドロステ8への対応を担当するようにOR7D4を同定した。逆に、あるORは、受容体応答プロファイル10を決定するために、臭気物質のパネルに対してスクリーニングすることができる。候補嗅覚着臭剤/ OR対は、これらの画面を介して確認された場合、相互作用は、臭気物質の濃度の増加にORの応答を検査する用量反応実験を行うことによって確認することができる。用量応答曲線はまた、進化の種および因果的突然変異を横切る受容体の進化の検査を可能にする、ORの変動は、インビトロ臭剤応答8,9,11,35 に影響し、これらの研究は種間OR変動に拡張することができる方法を評価することができる遺伝36,37は 、最終的に、このアッセイは、既知の着臭剤/受容体対38,39のために拮抗OR特定の臭気物質に応答することができる匂いのアンタゴニストをスクリーニングするために使用することができる。要約すると、これは、高スループットルシフェラーゼアッセイを特徴付ける助けるOR活性化パターン及び嗅覚系における臭気符号化のより良い理解を提供する研究の範囲に適用可能である。

プロトコル

1。Hana3A細胞の培養に

  1. 10％（V / V）FBSを最小必須培地（MEM）を補完することにより、M10のメディアを準備します。
  2. 培養維持
    1. M10培地中で細胞を維持する。注：RTP1L、RTP2、REEP1、Gのための発現ベクターは、Hana3A細胞にピューロマイシン耐性を付与するαolfますが、この抗生物質で細胞を維持することは、大幅に検定結果には影響しません。
    2. 10cmの皿で1:8の比率を2〜3日ごとにサブカルチャー。
    3. 5％のCO 2、37℃でインキュベートする。

2。トランスフェクションのために細胞をプレーティング

  1. Hana3A細胞を100％コンフルエント10cmディッシュから培地を吸引。
  2. 、10mlのPBSを加える料理を旋回し、PBSを吸引して細胞を洗浄します。
  3. 0.05％トリプシン/ EDTAの3ミリリットルを加え、細胞が（約1分）解離するのを待ちます。
  4. 5ミリリットルM10を追加することにより、トリプシンを不活性化し、およそ10倍＆を粉砕することにより、細胞塊を壊す＃160; 10ミリリットルピペットで。ピペットを慎重にメディアに気泡を導入しないようにします。
  5. 各96ウェルプレートについて15ミリリットルに、転写1mlの細胞を円錐管、5分間、200×gで遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引する。
  6. ステップ2.5で導入細胞の1ミリリットルあたり6ミリリットルM10に細胞を再懸濁。
  7. ピペット96ウェルプレートの各ウェルに50μlの細胞と、5％CO 2、37℃で一晩インキュベートする。

嗅覚受容体の3。トランスフェクション

  1. プラスミドDNAの調製
    1. エンドトキシンフリーのプロトコルを介してプラスミドDNAを調製。注：指定された使用のプラスミドDNA調製用キット「エンドトキシンフリー」、またはプラスミドDNA調製プロトコルにフェノール - クロロホルム抽出工程を追加します。
    2. TE緩衝液中100 ngの/μLの濃度にDNAを希釈します。
  2. 近似​​の適切な集密度を確保するために播種した細胞（ステップ2.7）を観察tely 30-50ウェルあたり％、インキュベーターに戻ります。注：このフルエンシーは、脂質トランスフェクション試薬には最適ではないですが、この段階で30から50までパーセントの集密度は、トランスフェクション後のルシフェラーゼ活性の24時間を測定するために最適である。
  3. トランスフェクションミックスの調製
    1. プラスミドミックスするために、表1に詳述されたボリュームごとにMEM培地にピペットRTP1S-PCI、M3-R-PCI、のpCRE-LUCとしたpSV40-RLプラスミド（示さボリュームは96ウェルプレートあたりの金額です。）
      プラスミドミックス
      ウェルあたり 96ウェルプレート当たり
      MEM - 500μL
      RTP1S-PCI 5 NG 480 NG
      M3-R-PCI 2.5 ngの 240 NG
      のpCRE-LUC 10 NG 960 NG
      たpSV40-RL 5 NG 480 NG

      表1。プラスミドミックス成 ​​分。ウェルあたりとRTP1S-PCI、M3-R-PCI、のpCRE-LUCとしたpSV40-RL、およびMEMの96ウェルプレートボリュームあたり。
    2. 各96ウェルプレートについては、450μlのMEM培地中の18μlの脂質トランスフェクション試薬を希釈する。
    3. ピペットプラスミドミックス（ステップ3.3.1から）、PCIプラスミド（ロー-OR-PCI）におけるロドプシンタグ付き嗅覚受容体、および中複雑、詳細にする（ステップ3.3.2から）脂質トランスフェクションミックス表2砕により溶液を混合し、15分間室温でインキュベートする。 表2によるM10を添加して反応を停止します。注：この反応は、時間と小文字が区別され、30分以上継続させてはいけません。ウェル+ 10％の計算は、後の工程のために十分な容積を確保することが重要である。
      複雑な
      ウェルあたり ウェルあたり+10％
      プラスミドミックス 4.2μL 4.58μL
      ρ-OR-PCI 0.05 NG 0.06 NG
      脂質トランスフェクションミックス 4.2μL 4.58μL
      M10 41.7μL 45.83μL

      表2。複合成分。ウェル当たり、プラスミド混合物（ 表1）のウェル+ 10％の量、嗅覚受容体プラスミド（Rho-イソたpCI-OR）、および脂質トランスフェクション混合物あたり。 M10を室温で15分間のインキュベーション後、反応をクエンチするために添加される。
  1. 細胞プレート上のメディアをタップします。
  2. ピペット50を各ウェルに複合μlの5％CO 2、37℃で一晩インキュベートする。

4。臭気刺激

  1. ウェルあたり50〜80パーセントの適切​​な集密度を確保するために、トランスフェクションされた細胞を観察し、インキュベーターに戻す。注：細胞は、50未満である場合％コンフルエント、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ読み取りは、受容体活性化の測定のためには低すぎるであってもよい。プレートを捨てることを検討してください。
  2. DMSO中の各臭気の1Mのストック溶液を準備します。
  3. CD293培地中の匂い刺激溶液を準備します。
    1. スクリーニング実験のために、100μMまで匂いの原液を希釈。また、（のみCD293）またはバックグラウンド活性化のために制御するために、無臭気制御を準備します。注：実験をスクリーニングするために、各OR /臭気ペアは一度だけ、実験ごとにテストされています。井戸間でいくつかの臭気の拡散が可能なので、各プレートについて1着臭剤で刺激することをお勧めします。
    2. 用量反応実験のために、各受容体のために1 mMのから始まる三重で臭気原液の7の10倍連続希釈液を調製する。また、臭気の背景活性化のために制御するために、空のベクターをトランスフェクトした細胞のための三重に同じ匂い希釈液を調製する。 NOTE：用量応答実験のために、それぞれODOR濃度処理が3回実施されるべきである。
  4. 細胞プレート上のメディアをタップします。
  5. ピペット各ウェルに匂い刺激溶液25μlと4時間インキュベートすること。

ルシフェラーゼアッセイを経由して5。測定又は活動

  1. -80℃で、製造元の指示や店舗ごとに再懸濁し、ホタルルシフェラーゼ基質
  2. 96ウェルプレート当たりホタルルシフェラーゼ基質1mlの解凍する。
  3. クエンチャー新鮮ホタルルシフェラーゼ反応を準備し、 ウミシイタケルシフェラーゼ基質試薬（緩衝液1mlあたり5μlのルシフェラーゼはクエンチャー/ シイタケルシフェラーゼ基質）。注：約1ミリリットルの試薬を96ウェルプレート当たりに必要とされる。
  4. 発光マイクロプレートリーダーを準備します。マイクロプレートリーダーソフトウェアを開きます。システムアイコンの中：
    1. 「予熱」タブで、「ON」のチェックボックスをオンにし、25℃に、機械の温度を設定; C.
    2. 「ディスペンサー」タブの下で、70％エタノール1,000μLとプライム各ディスペンサーは、蒸留水1,000μLが続く。注：各ディスペンサー用アルコールと水の別々のアリコートを使用してください。エタノールはディスペンサーを消毒するために使用され、水が残留エタノールを除去する。
    3. プライム空気の1500μlの各ディスペンサー（液体からディスペンサーを削除します）。注意：AIRでのプライミングは、ルシフェラーゼ基質が残留水で希釈されていないことを保証します。
    4. （ステップ5.2から）ホタルルシフェラーゼ基質1,080μLと首相ディスペンサー1。 （ステップ5.3から） ウミシイタケルシフェラーゼ基質と首相ディスペンサー2。注：未クロス汚染ルシフェラーゼ基質に注意してください。ルシフェラーゼの基質とプライミング試薬ディスペンサー内のデッドスペースを埋める。
  5. 両方のホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ発光を読むために以下のプロトコルを設定します。マイクロプレートリーダー、国連と関連するソフトウェア内「ファイル」メニューをデア、「新しいタスク」をクリックしてください。 「プロトコル」を強調表示し、「新規作成」をクリックしてください。次のウィンドウで、次の「標準プロトコル」の円を選択する必要があります。 「OK」をクリックします。画面の左側の「手順」をダブルクリックします。
    1. ディスペンサー1を使用して、すべてのウェルにホタルルシフェラーゼ基質を10μlを分注する。「アクション」メニューで、「スペンス」をクリックしてください。 「分注ステップ」ウィンドウで、設定：「ディスペンサー」を1に、誰にも負けない「プライミング」、10μLおよび225μL/秒の「速度」に「ボリュームを分注する」。 「OK」をクリックします。
    2. 30秒間、プレートを振る。 「アクション」メニューで、「シェイク」をクリックしてください。 SS： "シェイクステップ」ウィンドウで、中、夜12時30分、MMを「時間」を「強」に設定してください。 「OK」をクリックします。
    3. ウェルあたり0.5秒全てのウェルの発光をお読みください。 「アクション」メニューで、「読む」をクリック;。 SS、「フィルタセット」を1に、「発光」：午後12時00分50秒、MMに「検出方法」エンドポイントに発光、「読む種類」、「積分時間」：SS設定ウィンドウ、「ステップをお読みください」の穴に、先頭に「光学位置」、135が「ゲイン」とは、1.00ミリメートルに "高さをお読みください」。 「OK」をクリックします。
    4. ディスペンサー2を使用して、すべてのウェルにウミシイタケルシフェラーゼ基質を10μlを分注する。2に設定を除いて、ステップ5.6.1のように「ディスペンサー」の条件を設定します。
    5. 30秒間、プレートを振る。ステップ5.6.2のように条件を設定します。
    6. ウェルあたり0.5秒全てのウェルの発光をお読みください。ステップ5.6.3のように条件を設定します。
  6. 96ウェルプレートからふたを外し、マイクロプレートリーダーでプレートを配置します。プレート発光を読むためにステップ5.5で設定したプログラムを起動します。
  7. 試薬分注ポンプを清掃してください。 「ディスペンサー」タブの下にあるシステムアイコンから：
    1. Fの千μLをパージ回収管にホタルルシフェラーゼディスペンサーからireflyルシフェラーゼ基質。 NOTE：ホタルルシフェラーゼは、-80℃で保存して再利用することができる。
    2. 首相の70％エタノール千μLに続く蒸留水1,000μL、、最終的に空気の1,500μL（液体からディスペンサーをはずして）、各ディスペンサー。注：水が試薬ポンプ、エタノール消毒しからのルシフェラーゼの基質を除去し、空気が残留エタノールを乾燥させる。

6。データ解析

  1. データのエクスポート
    1. マイクロプレートリーダーソフトウェアでは、画面左側の「レポート/エクスポート·ビルダー」をダブルクリックします。
    2. ボタン「Excelへの新たな輸出」をクリックし、「OK」をクリックします。
    3. EXPORT1をハイライト表示し、「編集」をクリックします。
      1. 「コンテンツ」の「システムの説明」を確認し、「手順」、「プレートの説明」、および「レイアウトマトリックスプレート」。 「生データ」が含まれるND「データの計算」。
      2. 「ワークフロー」の下で、「手続きの完了にする自動実行」を確認してください。エクスポートモードの下では、「新しいワークシートとして ""同じブック内のすべてのプレート "をチェックして。
      3. 「ファイル」ファイル名の形式とファイルの場所を選択し、「OK」をクリック下に。
      4. 「レポート/エクスポート·ビルダー」ウィンドウを閉じます。
  2. 正規化されたルシフェラーゼの値を取得するには、各ウェルのためのウミ発光読み取り（ステップ5.6.6）で各ウェルのためのホタルルシフェラーゼ発光読み取り（ステップ5.6.3）を分割します。

結果

一次スクリーニングでは、100μMの濃度で26悪臭に対して328 ORをテストしました。この臭気濃度を効果的に既知のリガンド10との論理和の大部分を活性化することが実証されている。まず、正規化されたルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ読み取りによってホタルルシフェラーゼ読み取りを割ることによって計算した。次に、ベースライン値は、各ウェル（ ?...

ディスカッション

同一性は、付臭剤の嗅覚受容体活性化パターンによって符号化されるが、受容体は活性化され、どの程度にしているなどの受容体の活性化パターンは、ヒト嗅覚受容体1-11未満の6％のために知られている。嗅覚受容体を特徴づけるための努力は、嗅覚受容体ファミリー17,23,24,33,34のサブセットだけに彼らの労働集約的な方法や適用性によって制限されています。 Hana3A異種発現?...

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

この作品はR01 DC013339、R03 DC011373、ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞T32 DC000014によってサポートされていました。作品の一部は、NIH-NIDCDコアグラントをP30 DC011735からの資金によって部分的にサポートされていモネル化学感覚受容体シグナルコアを用いて行った。著者は、データ収集のヘルプのために-80 Sezilleに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
Hana3A cellsAvaiable from the Matsunami Laboratory upon request
RTP1S-pCIAvaiable from the Matsunami Laboratory upon request
M3-R-pCIAvaiable from the Matsunami Laboratory upon request
pCRE-lucAgilent219076LUC
pSV40-RLPromegaE2231RL
Minimum Essential Media, EagleSigma AldrichM4655MEM
FBSLife Technologies16000-044FBS
PBS (without Ca2+ and Mg2+)Cellgro21-040-CVPBS
Trypsin (0.05% Trypsin EDTA)Life Technologies25300Trypsin
CD293Life Technologies11913-019CD293
96 well PDL white/clear plateBD BioCoat356693plates
Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019Lipofectamine
Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo AssayPromegaE2980dual glo
Synergy S2 BioTekSLADBioTek S2
Microplate reader software: Gen5 Data Analysis SoftwareBioTekGen5Gen5
BIOSTACKBioTekBIOSTACK2WRBioStack
MultifloBioTekMFPMultiFlo
300ul GripTipsIntegra4433GripTips
12.5ul GripTipsIntegra4414GripTips
300ul GripTips ViaFlo96Integra6433XYZ tips
12.5ul GripTips 384 XYZIntegra6403XYZ tips
384ViaFloIntegra6030384ViaFlo
TE bufferMacherey Nagel740797.1
DMSOSigma AldrichD2650-100MLDMSO
forskolinEnzo Life SciencesBML-CN100-0010FOR

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