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Resumo

Padrões de ativação de receptores olfativos codificar identidade odor, mas a falta de dados publicados que identificam ligantes olfativos para receptores olfativos mamíferos impede o desenvolvimento de um modelo abrangente de codificação odor. Este protocolo descreve um método para facilitar a identificação de alto rendimento de ligandos de receptores olfactivos e quantificação da activação do receptor.

Resumo

Fragrâncias criar padrões únicos e sobrepostos de ativação do receptor olfativo, permitindo que uma família de aproximadamente 1.000 murino e 400 receptores humanos de reconhecer milhares de odorantes. Ligantes odorantes foram publicados para menos de 6% dos receptores humanos 1-11. Esta falta de dados é devido, em parte, às dificuldades funcionalmente que expressam estes receptores em sistemas heterólogos. Aqui, nós descrevemos um método para expressar a maioria da família do receptor olfactivo, em células Hana3A, seguido por uma avaliação de elevado rendimento de activação do receptor olfactivo utilizando um ensaio de repórter de luciferase. Este ensaio pode ser usado para (1) painéis de tela de odorantes contra painéis de receptores olfactivos; (2) confirmar a interação odorante / receptor via curvas de dose-resposta; e (3) comparar os níveis de ativação dos receptores entre variantes de receptores. Em nossos dados da amostra, 328 receptores olfativos foram triados contra 26 odorantes. Pares Odorant / receptores com diferentes contagens de resposta foram selected e testado em resposta à dose. Estes dados indicam que um ecrã é um método eficaz para enriquecer os pares odorante / receptoras que vai passar uma experiência de resposta a dose, isto é, os receptores que têm uma resposta bona fide para um odorante. Portanto, este ensaio de luciferase de alto rendimento é um método eficaz para caracterizar olfativo receptores de um passo essencial em direção a um modelo de codificação odor no sistema olfativo dos mamíferos.

Introdução

O sistema olfactivo dos mamíferos tem a capacidade de responder a um grande número de estímulos odoríferos, permitindo a detecção e a discriminação de milhares de odorantes. Receptores olfativos (RUP) são os sensores moleculares expressas pelos neurônios sensoriais olfativos no epitélio olfativo 12. Reconhecimento odor de mamíferos ocorre através da ativação diferencial das RUP por odores, ea família ou gene é extensa, com cerca de 1.000 murino e 400 receptores humanos 12-16. Análises funcionais anteriores do RUP em neurônios olfativos e em células heterólogas têm demonstrado que diferentes odores são reconhecidos pela única, mas a sobreposição de conjuntos RUP 10,17-20. Ligantes Correspondência para RUP é fundamental para a compreensão do código olfativo e essencial para a construção de modelos viáveis ​​de olfato. Devido às dificuldades de expressar RUP em sistemas heterólogos, bem como o grande número de ambos os odorantes e RUP, estes dados tem sido largamente ausente do field; de facto, menos de 6% de RUP humanos têm um ligando publicado 1-11. Este protocolo descreve o uso de um ensaio de luciferase para a caracterização do odorante / ou interacções. Este ensaio permite a caracterização de alto rendimento das RUP, uma tarefa que é essencial para a compreensão de odorante / ou interações, bem como o desenvolvimento de um modelo de codificação odor.

Estudos de alto rendimento de RUP enfrentam três grandes desafios. Primeiro, RUP expressos em células heterólogas foi retida no ER e subsequentemente degradados no proteassoma 21,22, impedindo as RUP de interagir com odorantes no sistema de ensaio de 23-25. Este problema foi resolvido com a descoberta de proteínas acessórias que facilitam a expressão da superfície celular estável de uma ampla gama de RUP 19,26,27. Receptor-transportador proteínas 1 e 2 (RTP 1 e 2) promover a expressão ou da superfície celular e activação em resposta à estimulação do odorante 19. Com base neste trabalho, células HEK293T forammodificada para expressar de forma estável a longo RTP 1 (RTP1L) e RTP 2, receptor de aumentar a expressão da proteína 1, e L αolf, resultando na linha celular Hana3A 19,27. Além disso, o receptor de acetilcolina de tipo 3 muscarínica (M3-R) interage com o RUP na superfície da célula e aumenta a activação em resposta aos odores 26. A co-transfecção de um OU com RTP1S e M3-R em Hana3A células resulta na expressão robusta, consistente, e funcional de uma ampla gama de RUP na superfície da célula 27. Em segundo lugar, mamíferos ou repertórios são bastante grandes. Nos seres humanos, por exemplo, o repertório OR é uma ordem de magnitude mais numerosos do que o repertório de receptores gustativos, e duas ordens de magnitude mais numerosos do que o repertório de receptor visual. Embora a clonagem de um único OR é um protocolo relativamente simples, o esforço up-front significativa é necessária para gerar uma biblioteca abrangente. Em terceiro lugar, embora saibamos que na visão, comprimento de onda se traduz em cor ena freqüência de audição se traduz em campo, a organização de odores é mal compreendida, o que torna difícil para os pesquisadores para interpolar a partir de uma amostra representativa de odorantes. Apesar de alguns progressos foram feitos nesta frente 10,28, o mapa da paisagem olfativa permanece incompleta. Triagem dezenas de milhares de moléculas contra centenas de RUP é uma tarefa difícil; telas de alto rendimento neste domínio exigem campanhas cuidadosamente definidos. Os principais desafios que restam são as de logística e custo, em vez de problemas inerentes à técnica. Apesar de triagem heteróloga não tem sido amplamente utilizada para identificar ligantes por grupos acadêmicos, uma empresa privada tem usado a mesma técnica para identificar ligantes para 100 RUP humanos 29. Infelizmente, esses dados são proprietários.

O ensaio de luciferase de elevado rendimento descrita aqui tem várias vantagens sobre os métodos alternativos utilizados para avaliar ou activação. Embora a responses de neurônios olfatórios nativas foram medidos utilizando eletrofisiologia e de imagem de cálcio, estas técnicas têm dificuldade provocando além OR que leva à resposta de um neurônio devido à sobreposição de propriedades de resposta de neurônios olfativos. Embora a bater-se um tipo de receptor marcado com GFP 30,31, entregando receptores específicos através de adenovirus para murino neurónios olfactivos 32,33, ou realizando RT-PCR após gravações 17,24,33 pode ligar gravações de tipos de receptores individuais, estes métodos são baixo rendimento e não é adequado para telas de grande escala. Sistemas de rastreio heterólogas são mais escalável e duas formas principais são encontradas na literatura: repórteres via inositol trifosfato de acampamento e (IP3) repórteres da via. Após a estimulação de odor, RUP activar uma cascata de sinalização L transdução αolf que resulta na produção de AMP cíclico (AMPc) 12. Por co-transfecção de um gene repórter da luciferase de pirilampo sob o controlo de ACElemento de resposta a AMP (CRE), a produção de luciferase pode ser medido como uma função de resposta de odor, o que permite a quantificação de OU activação. OU a activação pode também ser ligada à via de IP3 por co-expressando proteínas-G tais como G α15/16 ou um L-α15 olf quimera 24,25,34. Nós escolhemos o ensaio aqui apresentado com base em três fatores: (1) a co-expressão da RTP1 com receptores olfativos Rho-tag melhora a expressão de receptores olfativos na superfície da célula 19,27; (2) utilização de um gene repórter de AMPc-responsiva permite a medição de OU activação através da via do segundo mensageiro canónica; e (3) o ensaio é adequado para telas de alto rendimento.

Este ensaio de luciferase de alta produtividade é aplicável a uma variedade de estudos valiosos para o campo do olfacto. Primeiro, um grande número de RUP podem ser rastreados contra um único odorante, a fim de determinar o padrão de activação do receptor por um spodorante ESPECÍFICOS. Este tipo de estudo identificou OR7D4 como o OR responsável por responder ao androstenona odorante esteróide 8. Por outro lado, uma ou podem ser rastreados contra um painel de odores, a fim de determinar o perfil de resposta do receptor de 10. Quando o candidato olfactiva odorante / OU pares são identificados através dessas telas, a interacção pode ser confirmada através da realização de uma experiência de resposta à dose de exame da resposta do OR a concentrações crescentes de odorante. Curvas de resposta de dose também pode avaliar como a variação genética em um OR afeta em resposta odorante vitro 8,9,11,35, e esses estudos podem ser estendidos para interespecífica ou a variação, permitindo a análise da evolução receptor entre espécies e mutações causais em evolução 36,37, Finalmente, este ensaio pode ser usado para o rastreio de antagonistas de odor, que são capazes de antagonizar a resposta ao OU um odorante particular para um par odorante / receptor conhecido 38,39. Em resumo, esta altaEnsaio de luciferase-throughput é aplicável a uma gama de estudos que ajudarão caracterizar ou padrões de ativação e proporcionar uma melhor compreensão da codificação odor no sistema olfativo.

Protocolo

1. Cultura de Células Hana3A

  1. Prepare a mídia M10, completando meio mínimo essencial (MEM) com 10% (v / v) de FBS.
  2. Cultura de manutenção
    1. Manter as células em meios de M10. NOTA: Os vetores de expressão para RTP1L, RTP2, REEP1 e G αolf conferir resistência puromycin às células Hana3A, mas mantendo as células com este antibiótico não afeta significativamente os resultados do ensaio.
    2. Subcultura a uma proporção de 1:08 em placas de 10 cm a cada 2-3 dias.
    3. Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2.

2. Células Plating para transfecção

  1. Mídia aspirado de 100% confluente 10 centímetros prato de células Hana3A.
  2. Lave as células pela adição de 10 ml de PBS, agitando o prato, e aspirar o PBS.
  3. Adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA e esperar para dissociar as células (cerca de 1 minuto).
  4. Inativar a tripsina, adicionando 5 ml M10 e quebrar aglomerados de células por trituração aproximadamente 10x eº 160, com uma pipeta de 10 ml. Pipeta com cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar dentro da mídia.
  5. Para cada placa de 96 poços, a transferência de um ml de células para um tubo de 15 ml, centrifugar a 200 xg durante 5 min, e aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular.
  6. Ressuspender as células em 6 ml de M10 por 1 ml de células transferidas no passo 2.5.
  7. Pipetar 50 ul de células para cada poço de uma placa de 96 cavidades e incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2.

3. Transfecção de Receptores olfativos

  1. Preparação do ADN O plasmídeo
    1. Preparar DNA de plasmídeo, através de um protocolo livre de endotoxina. NOTA: preparação kits usam DNA de plasmídeo designado "livre de endotoxina," ou adicionar um passo de extracção com fenol-clorofórmio, para o protocolo de preparação de ADN de plasmídeo.
    2. Dilui-se o ADN a uma concentração de 100 ng / mL em tampão de TE.
  2. Observar células plaqueadas (Passo 2.7) para garantir uma confluência adequado de aproximaçãomadamente 30-50% por poço e voltar a incubadora. Nota: Embora esta confluência não é óptima para o reagente de transfecção de lípidos, uma confluência de 30-50% nesta etapa é óptima para a medição da actividade de luciferase 24 h após a transfecção.
  3. Preparação da mistura A transfecção
    1. Pipeta RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pcre-luc e pSV40-RL plasmídeos em meio MEM por os volumes detalhados na Tabela 1 para fazer a mistura do plasmídeo (volumes indicados são por placa de 96 poços).
      Mix plasmídeo
      por poço por placa de 96 poços
      MEM - 500 ul
      RTP1S-PCI 5 ng 480 ng
      M3-R-PCI 2,5 ng 240 ng
      pcre-luc 10 ng 960 ng
      pSV40-RL 5 ng 480 ng

      Tabela 1. Componentes da mistura. Plasmid por poço e por volumes de placas de 96 poços de RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pcre-luc e pSV40-RL, e MEM.
    2. Para cada placa de 96 poços, diluir 18 ul de reagente de transfecção de lípidos em 450 ul de meio MEM.
    3. Pipeta plasmídeo mistura (do Passo 3.3.1), o receptor olfactivo marcaram-rodopsina no plasmídeo pCI (Rho-OR-PCI), e mistura de transfecção de lípidos (a partir do passo 3.3.2) para fazer o complexo em detalhada Tabela 2. Misture a solução por meio de trituração e incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Parar a reacção adicionando M10 de acordo com a Tabela 2 NOTA:. Esta reação é sensível ao tempo e não deve ser autorizado a continuar por mais de 30 min. O cálculo bem + 10% é importante para assegurar um volume suficiente para os passos subsequentes.
      Complexo
      por poço por cavidade + 10%
      Mix plasmídeo 4,2 mL 4,58 mL
      Rho-OR-PCI 0,05 ng 0,06 ng
      Mistura de transfecção lipídica 4,2 mL 4,58 mL
      M10 41,7 mL 45,83 mL

      Tabela 2. Componentes complexos. Por poço e assim por + 10% de volume de mistura de plasmídeo (Tabela 1), o plasmídeo receptor olfactivo (Rho-OR-PCI), e mistura de transfecção lipídica. M10 é adicionado para parar a reacção após uma incubação de 15 min à temperatura ambiente.
  1. Toque fora da mídia sobre as placas de celulares.
  2. Pipetar 50 ul de complexo a cada poço e incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2.

4. Odor Estimulação

  1. Observar as células transfectadas para garantir uma adequada confluência de 50-80% por poço e voltar a incubadora. NOTA: Se as células são menos de 50% Confluentes, firefly luciferase e renilla luciferase leituras pode ser muito baixo para a medição de ativação do receptor. Considere descartando a placa.
  2. Preparar soluções stock 1 M de cada odor em DMSO.
  3. Preparar soluções de estimulação odor em meio CD293.
    1. Para experiências de rastreio, uma solução diluída de estoque de odor a 100 uM. Também preparar um controle sem odor (CD293 apenas), a fim de controlar ou a ativação de fundo. NOTA: Para os experimentos de triagem, cada par OR / odor é testada apenas uma vez por experiência. Porque alguma difusão de odor através poços é possível, recomenda-se a estimular com um odorante para cada placa.
    2. Para as experiências de dose-resposta, preparar sete diluições em série de 10 vezes de uma solução de estoque de odor em triplicado a partir de 1 mM para cada receptor. Também preparar as mesmas diluições de odor, em triplicado, para as células transfectadas com vector vazio, a fim de controlar a activação fundo odor. NOTA: Para os experimentos de dose-resposta, cada um otratamento concentração dor deve ser realizado em triplicata.
  4. Toque fora da mídia sobre as placas de celulares.
  5. Pipetar 25 ul de solução de estimulação odor a cada poço e incubar durante 4 horas.

5. Medição ou atividade através de ensaio de luciferase

  1. Ressuspender substrato firefly luciferase acordo com as instruções do fabricante e armazenar a -80 ° C.
  2. Descongelar 1 ml de substrato de luciferase do pirilampo por placa de 96 poços.
  3. Prepare a reacção da luciferase do pirilampo fresco quencher e reagente de substrato de luciferase de Renilla (5 ul da luciferase extintor / substrato de luciferase de Renilla por 1 ml de tampão). NOTA: Aproximadamente 1 ml de reagente é necessária por placa de 96 poços.
  4. Prepare o leitor de microplacas luminescente. Abra o software leitor de microplacas. Dentro do ícone do sistema:
    1. De acordo com a "pré-aquecimento" Tab, marque a caixa "ON" e ajustar a temperatura da máquina a 25 °; C.
    2. Na guia "Dispenser", primo cada dispenser com 1.000 l de etanol 70%, seguido por 1000 mL de água destilada. NOTA: Utilize alíquotas separadas de álcool e água para cada distribuidor. O etanol é usado para desinfectar os dispensadores e água remove o etanol residual.
    3. Primeiro cada dispenser com 1.500 l de ar (remover dispensadores de líquido). NOTA: priming com ar garante que substratos luciferase não são diluídos com água residual.
    4. Primeiro um dispensador com 1080 uL de substrato de luciferase de pirilampo (do Passo 5.2). Primeiro distribuidor 2 com substrato de luciferase de Renilla (do Passo 5.3). NOTA: Tenha cuidado para não contaminar os substratos luciferase. Priming com substratos luciferase preenche o espaço morto nos dispensadores de reagentes.
  5. Configure o seguinte protocolo para ler tanto vaga-lume e Renilla luciferase luminescência. Dentro do software associado ao leitor de microplacas, under o menu "Arquivo", clique em "Nova Tarefa". Destaque "Protocolos" e clique em "Criar novo". Na janela seguinte, o círculo ao lado de "protocolo padrão" deve ser selecionada. Clique em "OK". Dê um duplo clique em "Procedure" no lado esquerdo da tela.
    1. Dispensar 10 ml de substrato luciferase de vaga-lume a todos os poços que utilizam distribuidor 1. Sob o menu "Ações", clique em "Dispensar". Na janela "Dispensar Step", defina: "Dispenser" a 1 "Priming" a nenhum, "Volume Dispense" a 10 mL e "Rate" para 225 mL / seg. Clique em "OK".
    2. Agitar a placa por 30 seg. Sob o menu "Ações", clique em "Shake". Na janela "Agite Step", defina "Intensity" para Médio e "Duração" a 0:30 MM: SS. Clique em "OK".
    3. Leia a luminescência de todos os poços para 0,5 seg por poço. Sob o menu "Ações", clique em "Leia",. Na janela "Ler Step", defina: "Método de detecção" para luminescência, "Ler Tipo" para Endpoint, "Integração Time" para 00:00:50 MM: SS: ss, "Conjuntos de Filtros" para 1, "Emissão" para Hole, "Optics Position" para cima ", Gain" para 135, e "Ler Altura" a 1.00 mm. Clique em "OK".
    4. Dispensar 10 ml de substrato Renilla luciferase em todos os poços utilizando dispenser 2. Definir as condições como no Passo 5.6.1, exceto set "Dispenser" a 2.
    5. Agite placa por 30 seg. Definir as condições como no passo 5.6.2.
    6. Leia luminescência de todos os poços para 0,5 seg por poço. Definir as condições como no passo 5.6.3.
  6. Remover a tampa da placa de 96 poços e colocar a placa no leitor de microplacas. Inicie o programa criado no Passo 5.5 para ler placa de luminescência.
  7. Limpe as bombas de doseamento de reagentes. A partir do ícone do sistema, na guia "Dispenser":
    1. Purifica 1.000 l de fsubstrato de luciferase irefly do dispensador de luciferase do pirilampo para um tubo de recuperação. NOTA: a luciferase de pirilampo podem ser armazenadas a -80 ° C e reutilizada.
    2. Primeiro cada dispensador com 1.000 mL de água destilada, seguido por 1,000 mL de etanol a 70% e, finalmente, 1,500 l de ar (remover distribuidores de líquido). NOTA: A água remove substratos luciferase das bombas reagentes, desinfecta etanol e ar seca qualquer etanol residual.

6. Análise de Dados

  1. Exportação de Dados
    1. No software leitor de microplacas, clique duas vezes no "Relatório / Exportação Builders" no lado esquerdo da tela.
    2. Clique no botão "New Export para o Excel" e clique em "OK".
    3. Destaque Export1 e clique em "Editar".
      1. Em "Content" cheque "Descrição do Sistema", "Procedimento", "Placa Descrição" e "Placa de layout Matrix". Incluir um "dados brutos"nd "Calculado de dados".
      2. Em "fluxo de trabalho", marque a opção "Executar Automaticamente após a conclusão do procedimento." Em Modo de Exportação, verifique "Todas as placas na mesma pasta de trabalho" e "Como uma nova planilha".
      3. Em "File" escolher o formato de nome de arquivo eo local do arquivo e clique em "OK".
      4. Feche a janela "Relatório / Exportação Builders".
  2. Para obter os valores normalizados luciferase, divida a luciferase de vaga-lume leitura de luminescência para cada poço (Passo 5.6.3) pela leitura de luminescência Renilla para cada poço (Passo 5.6.6).

Resultados

Um ecrã primário testadas 328 RUP contra odores 26, a uma concentração de 100 uM. Esta concentração de odor tem sido demonstrada para activar de forma eficaz uma grande proporção de RUP com ligandos que se sabe 10. Primeiro, a actividade de luciferase normalizada foi calculada dividindo a leitura de luciferase de pirilampo pela da luciferase de Renilla leitura. Depois, os valores baseline foram calculados subtraindo as leituras de luciferase normalizada para o controle de odor a partir das le...

Discussão

Identidade Odorant é codificada por padrões de ativação dos receptores olfativos, mas padrões de ativação dos receptores, incluindo os receptores que são ativados e em que grau, são conhecidos por menos de 6% dos receptores olfativos humanos 1-11. Os esforços para caracterizar receptores olfativos têm sido limitados por seus métodos de trabalho intensivo ou aplicabilidade a apenas um subconjunto da família de receptores olfativos 17,23,24,33,34. O sistema de expressão heterólogo Hana...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por R01 DC013339, R03 DC011373 e Ruth L. Kirschstein Serviço Nacional Research Award T32 DC000014. Uma parte do trabalho foi realizada através do Monell Chemosensory Receptor Signaling Core, que é suportado, em parte, pelo financiamento do P30 DC011735 NIH-NIDCD Núcleo Grant. Os autores agradecem C. Sezille para obter ajuda com a coleta de dados.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
Hana3A cellsAvaiable from the Matsunami Laboratory upon request
RTP1S-pCIAvaiable from the Matsunami Laboratory upon request
M3-R-pCIAvaiable from the Matsunami Laboratory upon request
pCRE-lucAgilent219076LUC
pSV40-RLPromegaE2231RL
Minimum Essential Media, EagleSigma AldrichM4655MEM
FBSLife Technologies16000-044FBS
PBS (without Ca2+ and Mg2+)Cellgro21-040-CVPBS
Trypsin (0.05% Trypsin EDTA)Life Technologies25300Trypsin
CD293Life Technologies11913-019CD293
96 well PDL white/clear plateBD BioCoat356693plates
Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019Lipofectamine
Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo AssayPromegaE2980dual glo
Synergy S2 BioTekSLADBioTek S2
Microplate reader software: Gen5 Data Analysis SoftwareBioTekGen5Gen5
BIOSTACKBioTekBIOSTACK2WRBioStack
MultifloBioTekMFPMultiFlo
300ul GripTipsIntegra4433GripTips
12.5ul GripTipsIntegra4414GripTips
300ul GripTips ViaFlo96Integra6433XYZ tips
12.5ul GripTips 384 XYZIntegra6403XYZ tips
384ViaFloIntegra6030384ViaFlo
TE bufferMacherey Nagel740797.1
DMSOSigma AldrichD2650-100MLDMSO
forskolinEnzo Life SciencesBML-CN100-0010FOR

Referências

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