El Grupo atencional Set Shifting: una medida de la flexibilidad cognitiva en ratones

Resumen

El objetivo de este protocolo es llevar a cabo un ensayo de comportamiento tales como el conjunto de atención el cambio de tareas (AST) para evaluar la flexibilidad cognitiva corteza prefrontal mediada en ratones.

Resumen

Cognitive impairment, particularly involving dysfunction of circuitry within the prefrontal cortex (PFC), represents a core feature of many neuropsychiatric and neurodevelopmental disorders, including depression, post-traumatic stress disorder, schizophrenia and autism spectrum disorder. Deficits in cognitive function also represent the most difficult symptom domain to successfully treat, as serotonin reuptake inhibitors and tricyclic antidepressants have only modest effects. Functional neuroimaging studies and postmortem analysis of human brain tissue implicate the PFC as being a primary region of dysregulation in patients with these disorders. However, preclinical behavioral assays used to assess these deficits in mouse models which can be readily manipulated genetically and could provide the basis for studies of new treatment avenues have been underutilized. Here we describe the adaptation of a behavioral assay, the attentional set shifting task (AST), to be performed in mice to assess prefrontal cortex mediated cognitive deficits. The neural circuits underlying behavior during the AST are highly conserved across humans, nonhuman primates and rodents, providing excellent face, construct and predictive validity.

Introducción

El set atencional cambio de tareas (AST) se desarrolló como una medida de la atención y la flexibilidad cognitiva en ratas más de una década ^1,2. AST es el modelo del componente intradimensional / extradimensional de la prueba de la batería neuropsicológica automatizada de Cambridge (CANTAB) que se utiliza para identificar la disfunción cognitiva en los seres humanos y los primates no humanos ^3,4. Mientras que la capacidad de aprender reglas simples permanece intacta, los déficits en el aprendizaje para modificar una respuesta cuando las reglas han cambiado se encuentran en pacientes que sufren de una variedad de trastornos neuropsiquiátricos (es decir, la esquizofrenia, trastorno obsesivo compulsivo, depresión), trastornos neurodegenerativos (es decir, la enfermedad de Parkinson) y en pacientes con lesiones de la corteza pre-frontal ^5. Más en general, estos pacientes se describen como teniendo déficits en la flexibilidad cognitiva. Déficits análogos han demostrado en ambos primates no humanos y roedores cuando las lesiones camisetaso la corteza prefrontal se han inducido ^1,6-8. Estos déficits indican un estado de falta de flexibilidad cognitiva o un deterioro de la capacidad de cambiar set atencional.

Un set atencional se forma cuando un sujeto se entera de que un conjunto de reglas se puede aplicar a estímulos complejos con el fin de diferenciar pertinente de las señales irrelevantes. Por ejemplo, en la AST, animales aprenderán a prestar atención y responder a la señal correspondiente (es decir, a medio excavar) e ignorar una señal irrelevante (es decir, olor), por el emparejamiento de un premio de comida con el medio. Esta asociación se refuerza luego en las tareas posteriores donde el tipo de excavación de medianas y olor cambios, pero la asociación emparejado entre el medio y la recompensa sigue siendo. Esta regla reforzada forma un conjunto cognitivo. Dos etapas dentro de los aspectos de protocolo AST medida de la flexibilidad cognitiva: la inversión y el cambio extra-dimensional. En la etapa de inversión, los estímulos previamente negativos dentro de una dimension (medio en este ejemplo) es ahora positivo, que desafía al animal a ignorar los estímulos positivos de la etapa anterior. Por ejemplo, si a medio cavar sentido fueron los estímulos positivos en la etapa anterior y papel fueron los estímulos negativos, ahora ocurre lo contrario. Esto desafía la flexibilidad del animal en que debe mantener el set atencional (es decir, el medio es la dimensión relevante), mientras que la alteración de la regla aprendida para el estímulo y el par de recompensa dentro de una dimensión. La formación de un conjunto atencional es desafiado en la etapa de cambio extra-dimensional, cuando la dimensión irrelevante (olor en este ejemplo) se convierte en la dimensión relevante. Una respuesta perseverative, como se indica por una selección continua usando la regla aprendida previamente, ya sea en fase refleja un déficit en la flexibilidad cognitiva.

Estudios de lesiones en ambos primates no humanos y roedores han demostrado regiones específicas de la corteza prefrontal se puede atribuir a la capacidad de Perform etapas particulares de la AST ^1,9. Las lesiones en la corteza orbitofrontal (OFC), una subregión de la corteza prefrontal (PFC), han demostrado inducir déficits en la reversión de aprendizaje en el AST ^8. Además, las lesiones en la corteza prefrontal (MPFC) plomo medial a dificultades específicas para realizar el turno extra-dimensional.

Aunque numerosos estudios utilizando el AST se han realizado en ratas y primates no humanos, relativamente pocos han utilizado AST como una medida de la función cognitiva en los ratones. Dada la facilidad de manipulación genética en ratones, y la necesidad crítica para medir la función de la corteza prefrontal en el estudio de una variedad de trastornos, adaptación y validación de esta medida de comportamiento en los ratones es una adición importante a la investigación sobre las enfermedades asociadas a la disfunción PFC. El protocolo se detalla aquí es una modificación del procedimiento por Birrell y Brown ¹ que está optimizado para su aplicación en ratones y refleja muchos de ratón-específic adaptaciones que han sido reportados previamente ^2,6,10-13.

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Protocolo

NOTA: Los animales utilizados en este estudio son de sexo masculino C57BL / 6J entre los 4 y 6 meses de edad para obtener resultados óptimos. Los ratones se mantuvieron en un ciclo luz de marcha atrás con el fin de probar convenientemente durante la fase activa (oscuro). Si la conducta se realiza en una habitación separada de la vivienda, los ratones se les permite por lo menos 1 hora de aclimatarse siguiente transporte a la sala de pruebas. Las pruebas de comportamiento se lleva a cabo bajo condiciones de luz roja minimizar la interrupción de la actividad normal de los ratones tan poco como sea posible mientras que todavía permite la iluminación adecuada experimentador controlar visualmente la sesión de prueba.

NOTA: Se llevaron todos los aspectos del procedimiento experimental descrito en el presente documento a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, octava edición (NRC) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio.

1. Configuración Experimental

1. Llenar moldes de cerámica (no poroso; 1.5 "de profundidad x 2,5" de diámetro), con borde interno con la excavación medio (aproximadamente 1 "de la parte inferior); rondas de papel de filtro cortados por la mitad y pegadas en el interior de atrás de cazuela (Figura 1)
2. Quiebre de cereales ligeramente dulce seco desayuno (premio de comida) - Honey Nut o variedades recubiertos de azúcar, en aproximadamente 20 piezas mg para las etapas de aclimatación, formación y las pruebas.
3. Hacer una serie atencional cambio de tareas (AST) cámara (Figura 1B): Aclimatarse tren y probar cada ratón en cámaras individuales; recomendar la producción de al menos 8 cámaras.
   1. Construir una cámara AST 12 "x 8" x 7 "; paredes y puerta de salida hechas de acrílico blanco opaco que es fácil de limpiar con etanol al 70%. El estilo guillotina, puerta de salida extraíble separa la cámara en una sala de espera (5 "x 8") y zona de pruebas (7 "x 8").
   2. Incluya una Despejado 5221; x7 "partición desmontable que separa dos lados del área de pruebas de manera uniforme; Corte tres ¼ "agujeros de diámetro en la porción inferior de la partición para permitir la inhalación de acceso, espaciadas 1" aparte y 1 "de la parte delantera de la partición (Figura 1C).

2. Descripción general del procedimiento (Figura 2)

1. Antes de AST, ratones domésticos individualmente y les permiten adaptarse a un ciclo de luz de marcha atrás durante al menos una semana.
2. Aclimatarse, entrenar y probar cada animal en las cámaras de pruebas individuales. Asigne a cada cámara a un ratón y limpia con etanol al 70% después de terminar el último día de pruebas. Esto reducirá al mínimo el estrés durante la prueba, haciendo el olor cámara como "en casa-jaula" o "yo".
3. Perfumar las macetas de ensayo 2 días antes de la prueba para permitir que el aroma se disipe; ratones no cavará en macetas que tienen un olor muy fuerte. Usando una jeringa con una aguja de 25 G, añadir aproximadamente 0,1 ml deaceite esencial para la parte superior del papel de filtro.

3. Manejo (días 1-8)

1. Maneje ratones a partir 8 días antes del primer día de la restricción de alimentos. Esto reducirá el estrés asociado con el manejo durante la prueba.
2. Pesar y pesos corporales récord cada día de manejo. Maneje cada ratón 2-3 minutos por día.
3. Si varios experimentadores han de participar en la prueba de un grupo de ratones, asegurar que cada investigador participa en el proceso de manipulación de aumentar la familiaridad con los experimentadores y reducir el estrés y la ansiedad experimentados en el entrenamiento o los días de prueba.
4. Continuar de manipulación y de grabación de los pesos a lo largo de la duración de la prueba.

4. La restricción alimenticia (Días 9-12)

1. A partir de 4 días antes del inicio de la aclimatación, lugar ratones en una dieta restringida para mantener los ratones en el 80-85% de su peso corporal libre de alimentación. Dé 1 gramo de alimento por ratón por día. Si el peso del cuerpo cae por debajodel rango especificado dar 2 gramos por día hasta que regresen al rango apropiado.
2. Coloque 2 moldes en la parte delantera de cada jaula con el fin de permitir que los ratones se aclimaten a las ollas de prueba. Estos son los mismos puntos utilizados para entrenar el ratón para excavar en busca de una recompensa de comida.
3. Añadir 2 gramos de alimento y 1 pieza de recompensa de comida (la mitad de una pieza de cereal en cada uno) en los moldes cada día durante 4 días.
4. Si el comportamiento se va a realizar en una habitación separada de aquel en el que se alojan los ratones, a partir del día 1 de la restricción de alimentos, los ratones de transporte a la sala de pruebas durante al menos 1 hr por día antes de volver a la sala de alojamiento para permitir ellos se aclimaten a la sala de pruebas.
5. En el último día de la restricción de alimentos, antes del inicio de la aclimatación, cambiar la ropa de cama jaula. La ropa de cama jaula no se cambiará de nuevo hasta después de completar la prueba para reducir el estrés o la ansiedad experimentada durante el entrenamiento y las pruebas (a menos que sea absolutamente necesario).
6. Mantenerratones en la restricción de alimentos hasta el final de la prueba. En los días de 13 a 17, dar de comer ratones después de la aclimatación, la formación, o las pruebas basadas en una estimación de la cantidad de recompensa alimentos consumidos (generalmente <1 g de bola de comida).

5. Aclimatación (días 13-14)

1. A partir de 2 días antes del inicio de la formación, realizar la aclimatación durante el ciclo de oscuridad bajo la luz roja.
2. Extender una pequeña cantidad de ropa sucia de la jaula en la cámara, esto reducirá el estrés de estar en un ambiente nuevo, introduciendo un familiar "casa-jaula" o "yo" olor a la cámara de pruebas (la misma cámara será utilizado para un solo ratón para la duración de la formación y las pruebas).
3. Coloque una cazuela con agua limpia en la sala de espera de la cámara; ratones no tienden a comer si no tienen acceso al agua.
4. Coloque los dos moldes que se han utilizado para la restricción de alimentos en la zona de pruebas con un premio de comida (~ 20pieza cereales mg) en cada uno.
5. Coloque el ratón en el área de espera; quitar la puerta de salida y deje que el ratón para explorar la cámara durante 1 hora.
6. Añadir continuamente recompensas de comida (~ 20 mg pieza cereales) a los moldes vacíos con el fin de animar a los ratones para explorar la zona de pruebas y las ollas con frecuencia.
7. Asegúrese de que el ratón se puede ver el experimentador durante todo el periodo de aclimatación de modo que la presencia del experimentador no es un factor de estrés añadido durante la prueba.

6. Formación (Día 15)

1. Coloque el ratón en el área de espera.
2. Coloca los moldes vacíos, que contienen cada uno un premio de comida (~ 20 mg pieza de cereales), en la zona de pruebas y levantar la puerta de salida. Permita ratón 3 min para recuperar ambas recompensas de comida. Repita este paso varias veces.
3. Añadir poco a poco las camas jaula aserrín / ratón para las ollas en ensayos posteriores. Permitir el ratón 3 minutos para recuperar la recompensa de comida de cada bote antes de terminar el trial. Una vez que el ratón se ha recuperado la recompensa de comida de cada bote, pasar a la siguiente prueba. Si el ratón no hace intentos de excavar una vez que el premio de comida está cubierta parcialmente, consejos pueden proporcionarse (es decir, espolvorear polvo de cereales en el área de la recompensa de comida, hacer una sangría en el aserrín en el área de la recompensa de comida, descubren parte de la recompensa de comida).
4. Siga añadiendo serrín / juegos de cama después de cada ensayo hasta que el premio de comida está totalmente cubierto y el ratón fiable demuestra la capacidad de excavar en una olla llena de encontrar el premio de comida.
5. Si un ratón no ha demostrado de forma fiable la capacidad de encontrar un premio de comida en una olla llena dentro de 2 horas del inicio de los entrenamientos, seguirá un segundo día de entrenamiento. Mantenga el ratón sobre la restricción de alimentos y repita este procedimiento al día siguiente.
6. Si el ratón no excavar en busca de una recompensa de comida después de dos días sucesivos, excluirlo del resto del experimento, y anotar como un "fallo al cavar" en el expregistro erimental.

7. Exámenes (Días 16-17):

1. En el primer día, probar la discriminación sencillo (SD), la discriminación compuesto (CD), la inversión (R1), y el desplazamiento intra-dimensional (IDS).
2. En el segundo día, pruebe el desplazamiento intra-dimensional 2 (IDS2), desplazamiento intra-dimensional 3 (IDS3), la inversión de 2 (R2; opcional), turno extra-dimensional (EDS).
3. Medios de par y aromas como se muestra en la Tabla 1.
4. A la hora de manejar el día de la prueba, los ratones dar una recompensa de comida para evitar una falta de concentración durante la prueba a causa del hambre. Desde este punto hasta el final del día de la prueba, no podrá servir de alimento a excepción recompensas por decisiones correctas.
5. Al comienzo de las pruebas, el uso de fórceps (limita la propagación de olores entre ollas), coloque un pedazo de la recompensa de comida en la olla que indica una elección correcta. La recompensa de comida debe estar completamente cubierta por los medios de comunicación (ver Figura 3). Para evitar un taco aroma de la recompensa de comida, espolvorear polvo de cereales oVER todas las ollas en el inicio de la etapa.
6. Coloque el ratón en el área de espera con la puerta de salida cerrada. Coloque las ollas a cada lado de la cámara de pruebas. La prueba comienza cuando se quita la puerta de salida y se inicia el temporizador. Permita que cada ratón de 3 min por juicio para tomar una decisión. Registre la elección (correcta o incorrecta) y el tiempo hasta que el ratón hizo una elección para cada ensayo.
   NOTA: Una "opción" es indicado por un intento de excavar, ya sea en bote. Una excavación sólo se registra como una opción si el ratón ha desplazado a los medios de comunicación y asomó su nariz lo suficientemente lejos en el espacio que crea para encontrar el premio de comida o lo suficientemente desplazado de los medios de comunicación para descubrir la recompensa de comida. Si un ratón no ha tomado una decisión a menos de 3 minutos, este se registra como otra opción (incorrecto).
7. Una vez que una elección se ha hecho ya sea para olla, retire la olla que no fue elegido de la cámara de pruebas. Si se hizo una elección correcta, permitirá el ratón para finalizar la recompensa de comida antes de colocar el ratón de nuevo enla sala de espera. Si se hace una elección incorrecta, permitir el ratón para explorar la olla para mostrar que no hay recompensa de comida para que la elección antes de devolver el ratón a la zona de espera.
8. Al final de cada ensayo, colocar el ratón de nuevo en la zona de espera y sustituir la puerta de salida.
9. Asegúrese de que el ratón se encuentra con el criterio de 8 ensayos correctos consecutiva para hacer avanzar a la siguiente etapa de la AST. Si un ratón no obtiene 8 decisiones correctas consecutivamente dentro de 50 ensayos, no logra esa etapa y no puede pasar a completar la prueba. 6 consecutivos sin opciones (3 min sin elección) es una falta de participación y prohíbe el ratón de pasar a la siguiente etapa.

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Resultados

La medida dependiente típica en esta prueba es el número de ensayos por etapa para satisfacer el criterio (o 8 opciones consecutivos correctos). La Figura 4A muestra el número medio de ensayos para satisfacer el criterio en cada etapa sin tratar ratones C57BL / 6J mediante el AST. Como los ratones forman un conjunto atencional en la dimensión de referencia correspondiente (olor o medios de comunicación), el rendimiento mejorará, como se indica por una reducción en los ensayos para cumplir con el ...

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Discusión

Los déficit en la flexibilidad cognitiva mediadas por el PFC representar una discapacidad significativa asociada con una variedad de trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos, y pueden tener un impacto importante en los resultados y la calidad de vida de las personas que sufren de estos trastornos. Optimización de la AST para su uso en ratones es de vital importancia para la investigación de las bases genéticas de las enfermedades acoplados a prefrontal disfunción cognitiva mediada cortical. Hemos encontrado q...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Testing Chamber			Fabricated in-house, specifications can be found in protocol
3 oz. Ramekins	BIA Cordon Bleu	900002S12	Purchased on amazon.com
Essential Oils:	Fronteir Natural Products Co-Op		Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo
Clove Bud		191114
Red Thyme		191140
Lemon		190810
Cinnamon Leaf		191111
Rosemary		191133
Citronella Java		191112
Vanilla in jojoba oil		191231
Anise Seed		191102
Ginger		191121
Nutmeg		191161
Filter Paper, 9.0 cm diameter	VWR International	28310-048	Purchased on https://us.vwr.com/
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Lightly sweetened dry breakfast cereal loops	HEB		Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended