A Task Attentional Set Shifting: uma certa flexibilidade cognitiva em ratos

Resumo

O objetivo deste protocolo é a realização de um ensaio comportamental, tais como o conjunto de atenção transferência de tarefas (AST) para avaliar a flexibilidade cognitiva prefrontal mediada pelo córtex em camundongos.

Resumo

Cognitive impairment, particularly involving dysfunction of circuitry within the prefrontal cortex (PFC), represents a core feature of many neuropsychiatric and neurodevelopmental disorders, including depression, post-traumatic stress disorder, schizophrenia and autism spectrum disorder. Deficits in cognitive function also represent the most difficult symptom domain to successfully treat, as serotonin reuptake inhibitors and tricyclic antidepressants have only modest effects. Functional neuroimaging studies and postmortem analysis of human brain tissue implicate the PFC as being a primary region of dysregulation in patients with these disorders. However, preclinical behavioral assays used to assess these deficits in mouse models which can be readily manipulated genetically and could provide the basis for studies of new treatment avenues have been underutilized. Here we describe the adaptation of a behavioral assay, the attentional set shifting task (AST), to be performed in mice to assess prefrontal cortex mediated cognitive deficits. The neural circuits underlying behavior during the AST are highly conserved across humans, nonhuman primates and rodents, providing excellent face, construct and predictive validity.

Introdução

O conjunto atencional transferência de tarefas (AST) foi desenvolvido como uma medida de atenção e flexibilidade cognitiva em ratos mais de uma década atrás, ^1,2. AST é modelado a partir do componente intradimensional / extra-dimensional da Cambridge neuropsicológica Teste Automático de bateria (Cantab), que é usada para identificar a disfunção cognitiva em seres humanos e primatas não-humanos ^3,4. Embora a capacidade de aprender regras simples permanece intacta, défices de aprendizagem para modificar uma resposta quando as regras mudaram são encontrados em pacientes que sofrem de uma variedade de distúrbios neuropsiquiátricos (por exemplo, esquizofrenia, distúrbio obsessivo compulsivo, depressão), desordens neurodegenerativas (por exemplo, A doença de Parkinson) e em pacientes com lesões no córtex pré-frontal ^5. Mais geralmente, estes pacientes são descritos como tendo os défices cognitivos na flexibilidade. Défices análogos têm sido mostrados em ambos os primatas não-humanos e roedores quando as lesões to córtex pré-frontal foram induzidas ^1,6-8. Estes déficits indicar um estado de inflexibilidade cognitiva ou uma capacidade prejudicada de mudar set atencional.

Um conjunto de atenção é formado quando um sujeito descobre que um conjunto de regras podem ser aplicadas a estímulos complexos, a fim de diferenciar relevante a partir de pistas irrelevantes. Por exemplo, na AST, os animais vão aprender a prestar atenção e responder à sugestão relevante (ou seja, cavando médio) e ignorar uma sugestão irrelevante (ou seja, odor), emparelhando uma recompensa alimentar com o meio. Esta associação é então reforçado em tarefas subsequentes, onde o tipo de escavação de médio e odor mudanças, mas a associação emparelhado entre médio e recompensa permanece. Esta regra reforçada forma um conjunto cognitivo. Dois estágios dentro dos aspectos medida protocolo AST de flexibilidade cognitiva: reversão ea mudança extra-dimensional. Na fase de inversão, os estímulos previamente negativos no prazo de um dimension (médio, neste exemplo) agora é positivo, o que desafia o animal a ignorar os estímulos positivos a partir da etapa anterior. Por exemplo, se sentiu meio de escavação foram os estímulos positivos na fase anterior e papel foram os estímulos negativos, agora o inverso é verdadeiro. Isso desafia a flexibilidade do animal em que a Europa deve manter o conjunto de atenção (ou seja, o meio é a dimensão relevante), alterando a regra aprendida para estímulo e recompensa par dentro de uma dimensão. A formação de um conjunto de atenção é contestada na fase de mudança extra-dimensional, quando a dimensão irrelevante (odor, neste exemplo) torna-se a dimensão relevante. Uma resposta perseverativo, como indicado por uma escolha contínuo usando a regra previamente aprendido, em qualquer fase reflecte um défice cognitivo em flexibilidade.

Estudos de lesões em ambos os primatas não-humanos e roedores mostraram regiões específicas do córtex pré-frontal pode ser atribuído à capacidade de perform estágios particulares do AST ^1,9. Lesões no córtex orbitofrontal (OFC), uma sub-região do córtex pré-frontal (PFC), foram mostrados para induzir déficits de aprendizado reverso na AST ^8. Além disso, lesões no córtex pré-frontal (MPFC) chumbo medial a dificuldades específicas na realização da mudança extra-dimensional.

Enquanto numerosos estudos utilizando a AST foram realizados em ratos e primatas não-humanos, relativamente poucos têm utilizado AST como uma medida da função cognitiva em ratos. Dada a facilidade de manipulação genética em ratos, e a necessidade crítica para medir a função do córtex pré-frontal em estudar uma variedade de doenças, adaptação e validar esta medida comportamental em ratos é um complemento importante para a investigação sobre doenças associadas à disfunção PFC. O protocolo detalhado aqui é uma modificação do procedimento por Birrell e Brown ^1, que é optimizada para a aplicação nos ratinhos, e reflecte muitas das rato-específic adaptações que foram reportados anteriormente ^2,6,10-13.

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Protocolo

NOTA: Os animais utilizados neste estudo são do sexo masculino camundongos C57BL / 6J entre 4 e 6 meses de idade, para os melhores resultados. Ratos são mantidos em um ciclo de luz inverso, a fim de testá-los convenientemente durante a fase ativa (escuro). Se o comportamento é realizado em uma sala separada da carcaça, os ratos são permitidos pelo menos 1 hora para se aclimatar seguinte transporte para a sala de ensaios. Teste comportamental é realizado sob condições de luz vermelha minimizar a perturbação da actividade normal dos ratos tão pouco quanto possível, enquanto ainda permitindo que o experimentador iluminação adequada para acompanhar visualmente a sessão de testes.

NOTA: Todos os aspectos do procedimento experimental aqui descritos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, 8ª (NRC) e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na Universidade do Texas em Ciências da Saúde Center em San Antonio.

1. Setup Experimental

1. Encha forminhas de cerâmica (não-poroso; 1.5 "profundidade x 2,5 cm de diâmetro), a borda interna com cavando meio (aproximadamente 1" a partir de baixo); rodadas de papel filtro de corte ao meio e colado dentro de trás do ramekin (Figura 1A)
2. Quebre levemente adoçado cereal seco pequeno-almoço (recompensa alimentar) - Nut mel ou variedades de açúcar revestido, em cerca de 20 peças mg para as fases de aclimatação, treinamento e teste.
3. Faça um conjunto de atenção transferência de tarefas (AST) câmara (Figura 1B): Aclimatar treinar e testar cada rato em câmaras individuais; recomendam produção de pelo menos 8 câmaras.
   1. Construa uma câmara AST 12 "x 8" x 7 "; muros e portão início feitas de acrílico branco opaco que é fácil de limpar com etanol 70%. O estilo guilhotina, removível portão de partida separa câmara em uma área de espera (5 "x 8") e área de testes (7 "x 8").
   2. Incluir um claro 5221; x7 "divisória amovível que separa os dois lados da área de testes de maneira uniforme; cortar três ¼ "buracos de diâmetro na parte inferior da divisória para permitir o acesso cheirar, espaçadas 1" distante e 1 "a partir da frente da partição (Figura 1C).

2. Visão geral do procedimento (Figura 2)

1. Antes da AST, ratos de casa individualmente e permitir-lhes para se ajustar a um ciclo de luz reversa para, pelo menos, uma semana.
2. Aclimatar, treinar e testar cada animal em câmaras de teste individuais. Atribuir cada câmara a um mouse e limpo com etanol a 70% depois de terminar o último dia de testes. Isso irá minimizar o estresse durante os testes, fazendo o cheiro câmara como "casa-gaiola" ou "self".
3. Perfume os vasos de ensaio 2 dias antes do teste para permitir o perfume para dissipar; camundongos não vai cavar em vasos que têm um odor muito forte. Usando uma seringa com uma agulha de 25 G, adicionar cerca de 0,1 ml deóleo essencial para a parte superior do papel de filtro.

3. Manutenção (Dias 1-8)

1. Lidar com ratos a partir de 8 dias antes do primeiro dia de restrição alimentar. Isso irá reduzir o estresse associado com a manipulação durante o teste.
2. Pesar e pesos corporais registro a cada dia de manuseio. Lidar com cada rato 2-3 min por dia.
3. Se vários experimentadores devem ser envolvidos em testar um conjunto de ratos, garantir que cada pesquisador participa do processo de manipulação para aumentar a familiaridade com os experimentadores e reduzir o estresse e ansiedade experientes no treinamento ou dias de testes.
4. Continuar manuseamento e pesos de gravação ao longo da duração dos testes.

4. A restrição alimentar (Dias 12/09)

1. Começando 4 dias antes do início da aclimatação, os ratos no lugar de uma dieta restrita para manter os ratos a 80-85% do seu peso corporal alimentar livre. Dê um grama de alimento por rato por dia. Se o peso do corpo cai abaixodo intervalo especificado dar 2 gramas por dia até que eles voltem para o intervalo apropriado.
2. Coloque 2 ramequins na frente de cada gaiola, a fim de permitir que os ratos se aclimatar para os vasos de teste. Estes são os mesmos pontos usados ​​para treinar o mouse para cavar para uma recompensa alimentar.
3. Adicionar 2 gramas de comida e uma peça de recompensa alimentar (metade de um pedaço de cereal em cada) em ramekins cada dia durante 4 dias.
4. Se o comportamento está a ser realizado numa sala separada do que aquela em que os ratos são alojados, começando no dia 1 de restrição alimentar, os ratinhos de transporte para a sala de teste durante pelo menos 1 hr por dia antes de voltar para a sala de alojamento para permitir eles se adapte à sala de ensaios.
5. No último dia de restrição alimentar, antes do início da aclimatação, mudar a cama gaiola de origem. A roupa de cama gaiola não será alterado novamente até após a conclusão do teste para reduzir o estresse ou ansiedade experimentada durante o treinamento e teste (menos que seja absolutamente necessário).
6. Manterem ratinhos restrição alimentar até ao final do teste. Nos dias 13-17, dar comida camundongos após aclimatação, treinamento ou de teste com base em uma estimativa da quantidade de alimentos consumidos recompensa (geralmente <1g de pellet de alimentos).

5. Aclimatação (Dias 13-14)

1. Começando 2 dias antes do início da formação, realizar aclimatação durante o ciclo escuro com luz vermelha.
2. Espalhe uma pequena quantidade de roupas de cama suja da gaiola na câmara, isso vai reduzir o estresse de estar em um novo ambiente através da introdução de um familiar "home-gaiola" ou "self" cheiro para a câmara de teste (a mesma câmara será usado para um único rato para a duração do treinamento e teste).
3. Coloque um ramekin limpo com água na sala de espera da câmara; camundongos tendem a não comer, se eles não têm acesso à água.
4. Coloque os dois ramequins que têm sido utilizados para a restrição alimentar na área de testes com uma recompensa de alimentos (~ 20pedaço de cereais mg) em cada.
5. Posicione o mouse na área de espera; remover a porta de início e permitir que o rato explorar a câmara durante 1 h.
6. Continuamente adicionar recompensas alimentares (~ peça cereal 20 mg) para os ramequins vazias a fim de incentivar os ratos para explorar a área de testes e as panelas com freqüência.
7. Certifique-se de que o rato pode ver o experimentador durante todo o período de aclimatação de modo que a presença do experimentador não é um estressor adicional durante o teste.

6. Treinamento (Dia 15)

1. Posicione o mouse na área de espera.
2. Coloque as forminhas vazias, cada uma contendo uma recompensa alimentar (~ peça cereal 20 mg), para a área de testes e levantar o portão de partida. Permitir mouse de 3 min para recuperar as recompensas alimentares. Repita este passo várias vezes.
3. Aos poucos, adicione serragem / rato cama gaiola para as panelas em ensaios subseqüentes. Permitir que o mouse 3 min para recuperar a recompensa alimentar de cada pote antes de terminar o triai. Uma vez que o rato tenha recuperado a recompensa alimentar de cada pote, passe para a próxima prova. Se o mouse não faz tentativas de cavar uma vez que a recompensa alimentar é parcialmente coberto, pode ser fornecido dicas (ou seja, polvilhe pó cereal sobre a área da recompensa alimentar, fazer um recuo na serragem sobre a área de recompensa alimentar, descobrir parte do recompensa alimentar).
4. Continue adicionando serragem / roupa de cama depois de cada julgamento até que a recompensa alimentar é totalmente coberto e o mouse demonstra de forma confiável a capacidade de escavar em um pote cheio de encontrar a recompensa alimentar.
5. Se um rato não demonstrou de forma confiável a capacidade de encontrar uma recompensa comida em um pote cheio dentro de 2 horas do início da formação, continuam a um segundo dia de treinamento. Manter o mouse sobre a restrição alimentar e repita este procedimento no dia seguinte.
6. Se o mouse não consegue cavar para uma recompensa alimentar depois de dois dias sucessivos, excluí-lo do restante do experimento, e anotar como um "não conseguiu cavar" no expregistro erimental.

7. Testes (Dias 16-17):

1. Em um dia, testar discriminação simples (SD), a discriminação composto (CD), a reversão (R1), e mudança intra-dimensional (IDS).
2. No segundo dia, testar a mudança intra-dimensional 2 (IDS2), shift intra-dimensional 3 (IDS3), a reversão 2 (R2; opcional), shift extra-dimensional (EDS).
3. Meios par e aromas, como mostrado na Tabela 1.
4. Na hora de lidar no dia de testes, camundongos dar uma recompensa alimentar para evitar a falta de foco durante os testes devido à fome. A partir deste ponto até ao final do dia de teste, não fornecem qualquer alimento excepto recompensas para escolhas correctas.
5. No início do ensaio, usando uma pinça (limita a propagação de cheiros entre potes), colocar um pedaço do alimento de recompensa no pote que indica uma escolha correcta. A recompensa de alimentos deve ser totalmente coberto pela mídia (ver Figura 3). Para evitar uma sugestão perfume da recompensa alimentar, polvilhe o cereal poeiraVER todas as panelas no início do estágio.
6. Posicione o mouse na área de espera com o portão fechado início. Colocar os vasos de ambos os lados da câmara de teste. O teste inicia-se quando a porta de início é removido e o temporizador é iniciado. Permitir que cada rato 3 min por tentativa de fazer uma escolha. Grave a escolha (correta ou incorreta) e tempo até o rato fez uma escolha para cada ensaio.
   NOTA: A "escolha" é indicado por uma tentativa de cavar em qualquer pote. A escavação só é registrado como uma escolha se o rato tem deslocado a mídia e cutucou seu nariz longe o suficiente no espaço ele cria para encontrar a recompensa alimentar ou o suficiente deslocadas da mídia para descobrir a recompensa alimentar. Se um rato não fez uma escolha dentro de 3 min, esta é registrada como outra opção (incorreta).
7. Uma vez que uma escolha foi feita para qualquer vaso, remover o pote que não foi escolhido a partir da câmara de teste. Se a escolha correta foi feita, permitir que o mouse para terminar a recompensa alimentar, antes de colocar o mouse de volta emárea de espera. Se uma escolha incorreta é feito, deixe o mouse para explorar o pote para mostrar que não há recompensa alimentar para essa escolha antes de retornar o mouse para a área de espera.
8. No final de cada ensaio, colocar o rato para trás na área de espera e substituir a porta de início.
9. Certifique-se de que o mouse se encontra com o critério de 8 ensaios corretos consecutivamente para avançar para a próxima fase da AST. Se um rato não obtenha 8 escolhas corretas consecutivas no período de 50 ensaios, ele falha nessa fase e não pode seguir em frente para completar o teste. 6 consecutivos sem escolhas (3 minutos, sem uma escolha) é um fracasso para participar e proíbe o mouse se mova para a próxima fase.

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Resultados

A medida dependente típico neste teste é o número de ensaios por cada fase para satisfazer o critério (ou oito escolhas correctas consecutivas). A Figura 4A mostra o número médio de ensaios para satisfazer critérios em cada fase não tratada C57BL / 6J usando a AST. Como ratinhos formar um conjunto de atenção sobre a dimensão relevante taco (odor ou meios), irá melhorar o desempenho, como indicado por uma redução em ensaios para satisfazer mudanças sucessivas no critério intradimensional,...

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Discussão

Déficits na flexibilidade cognitiva mediadas pelo PFC representar uma deficiência significativa associada a uma variedade de doenças neurológicas e neuropsiquiátricas, e pode ter um grande impacto sobre os resultados e qualidade de vida dos indivíduos que sofrem desses transtornos. Otimização da AST para uso em camundongos é vital para investigar as bases genéticas de doenças acoplados a pré-frontais disfunção cognitiva mediada cortical. Verificou-se que o método descrito acima é uma medida de confiança...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Testing Chamber			Fabricated in-house, specifications can be found in protocol
3 oz. Ramekins	BIA Cordon Bleu	900002S12	Purchased on amazon.com
Essential Oils:	Fronteir Natural Products Co-Op		Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo
Clove Bud		191114
Red Thyme		191140
Lemon		190810
Cinnamon Leaf		191111
Rosemary		191133
Citronella Java		191112
Vanilla in jojoba oil		191231
Anise Seed		191102
Ginger		191121
Nutmeg		191161
Filter Paper, 9.0 cm diameter	VWR International	28310-048	Purchased on https://us.vwr.com/
Digging Media
Raffia	Ashland 8 oz Raffia		Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips
Green Felt	Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in		Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares
Brown foam	Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan)		Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles
Crepe paper (yellow)	Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo		Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips
Ribbon (turqoise)	Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester		Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares
Metallic	Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz		Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips
Googly Eyes, 4 mm		ME4144	Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php
Black Sequins, 3 mm		8780BK
Pink Pom Poms, 1/4 inch		1018221
Pipe Cleaners, red		108430
Bedding material/sawdust			Obtained from in-house animal resources
Timer	Control Company	5000	Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm
Lightly sweetened dry breakfast cereal loops	HEB		Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended