Acquisizione di alta qualità video digitale di<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamenti larvali e adulti da una prospettiva laterale

Riepilogo

Qui si descrive una tecnica di microscopia semplice e ampiamente accessibili per acquisire video digitale di alta qualità di Drosophila adulti e fenotipi mutanti larvali da una prospettiva laterale.

Abstract

Drosophila melanogaster è un potente sistema modello sperimentale per studiare la funzione del sistema nervoso. Mutazioni genetiche che causano la disfunzione del sistema nervoso spesso producono larve e gli adulti che hanno locomozione fenotipi difettosi che sono difficili da descrivere adeguatamente con il testo o completamente rappresentare con una sola immagine fotografica praticabile. Modalità attuali di pubblicazioni scientifiche, tuttavia, sostengono la presentazione di supporti video digitali come materiale supplementare per accompagnare un manoscritto. Qui si descrive una tecnica di microscopia semplice e ampiamente accessibili per l'acquisizione video digitale di alta qualità di entrambi i fenotipi larve e adulti di Drosophila da una prospettiva laterale. Video di locomozione larvale e adulto da una vista laterale è vantaggioso perché permette l'osservazione e l'analisi delle sottili distinzioni e le variazioni nei comportamenti aberranti locomotiva. Abbiamo utilizzato con successo la tecnica di visualizzare e quantificare aberrant strisciare comportamenti terzo instar larve, oltre a fenotipi mutanti adulti e comportamenti, tra cui governare.

Introduzione

Il frutto comune mosca Drosophila melanogaster è un potente sistema modello sperimentale per lo studio della funzione del sistema nervoso ^1-3. Conservazione evolutiva di struttura e funzione del sistema nervoso con gli esseri umani, così come la facilità di manipolazione genetica e di una vasta gamma di strumenti genetici rende Drosophila l'organismo prima di modellare le malattie neurodegenerative umane ^4. Mutazioni genetiche che causano la disfunzione del sistema nervoso causano spesso vitale larve mutanti e adulti Drosophila con locomozione compromessa. Fenotipi osservati nel sistema nervoso mutanti difettosi includono il ridotto tasso di locomozione, coordinamento aberrante, e movimenti spastici negli adulti, così come deficit in contrazione peristaltica della muscolatura della parete del corpo, e la paralisi parziale delle larve. Questi fenotipi sono state sfruttate nello sviluppo di high-throughput schermi genetici e test di locomozione di larve mutanti ⁵, 6 e ^7-10 adulto Drosophila volta a quantificare la perdita di valore locomozione e l'identificazione dei geni necessari per il funzionamento del sistema nervoso. Mentre questi approcci sono estremamente utili per quantificare i comportamenti locomotive larvali e adulti, non riescono a trasmettere informazioni qualitative su ogni comportamento problema specifico. Ad esempio, mentre il mutante terzo instar larve può presentare parametri di locomozione alterati in un test comportamentale, può essere chiaro se questo è il risultato di alterazioni contrazioni peristaltiche ritmiche durante il ciclo di scansione, generale mancanza di coordinamento, o paralisi parziale del corpo posteriore muscolatura della parete. Qui si descrive una tecnica di microscopia semplice e ampiamente accessibili per l'acquisizione video digitale di alta qualità di Drosophila adulti e fenotipi locomotiva larvali da una prospettiva laterale. Il video digitale acquisito da una prospettiva laterale, permette l'osservazione diretta e l'analisi delle distinzioni sottili LocomotivE i comportamenti di un più informativo orientamento side-view.

Protocollo

1 Il sistema Microscopio Stereo

Nota: Anche se questo protocollo è facilmente adattabile a qualsiasi impianto stereo microscopio accoppiato ad una fotocamera digitale con la possibilità di acquisire video, dettagli sono riportati sul sistema utilizzato nel nostro laboratorio (Tabella dei materiali / attrezzature).

1. Acquisire video digitale utilizzando uno stereo microscopio trinoculare accoppiato ad una fotocamera digitale commerciale.
2. Per accoppiare la fotocamera digitale commerciale alla porta trinoculare del microscopio stereo, rimuovere il ½x C-mount del porto fototubo del microscopio stereo e sostituirlo con un 1X C-mount.
3. Montare un accoppiatore fotocamera digitale (filetto 43 millimetri) per la 1X C-mount.
4. Montare due anelli step-down, 58 mm a 48 mm, e 48 mm a 43 mm, per l'accoppiatore fotocamera per colmare la connessione dal accoppiatore fotocamera digitale ad un kit adattatore per lenti per la fotocamera digitale.
5. Montare la fotocamera digitale al kit adattatore per lenti.
6. Acquisire video con l'ingrandimento del microscopio e lo zoom ottico della fotocamera digitale impostata per un ingrandimento totale di circa 12X (30 fotogrammi al secondo, 640 x 480 pixel). Nota: L'ingrandimento del microscopio stereo deve essere compensato secondo la nuova riconfigurato 1X C-mount della porta trinoculare.

2 Imaging Drosophila larve terzo instar

1. Nastro un pennarello indelebile al piattello nero di un microscopio stereo accoppiato ad una fotocamera digitale in modo che il lato del tappo marcatore occupa circa ⅓ a ¼ del campo di vista verticale osservata nel monitor LCD della fotocamera. Utilizzare cime marcatori come il palco per eseguire l'imaging larvale perché vengono in un assortimento di colori che può essere utilizzato per codice colore e differenziare i genotipi di larve di essere ripreso.
2. Delimitare il campo di vista osservato nel monitor LCD della fotocamera digitale sulla superficie del piano marcatore con una punta finemarcatore.
3. Selezionare un terzo stadio larva di immagine. I criteri per la selezione larve al terzo stadio era lunghezza del corpo, emergere dalla fonte di cibo durante la fase larvale del ciclo di vita, la presenza di spiracoli anteriori e posteriori, e la struttura dei ganci mandibolari dell'apparato bocca ^11. Assicurarsi che la larva è pulito lavandolo accuratamente con acqua.
4. Illuminare la fase superiore pennarello indelebile dall'alto con luce da un sistema di illuminazione a fibre ottiche. Regolare l'angolazione della luce incidente per fornire l'illuminazione ottimale.
5. Mettere a fuoco il microscopio sul bordo del piano pennarello indelebile. Iniziare l'acquisizione video digitale.
6. Posizionare la larva sul lato del tappo marcatore di circa 75 ° rispetto all'asse verticale, appena fuori dal campo visivo, con l'anteriore della larva rivolta verso il campo di vista (Figura 1). Nota: Posizionamento della larva sul lato del tappo indicatore permette alla fotocamera di registrare il movimento di the larva da una prospettiva laterale. Aiuta a mantenere la larva umido con acqua in modo che non cadano fuori il lato del tappo marcatore. Prestare attenzione, tuttavia, non usare troppa acqua come quantità eccessive potranno aderire alla larva come si esegue la scansione attraverso il campo.
7. Colpire delicatamente e spingere la larva con un piccolo pennello per costringere a strisciare attraverso il campo di vista. Sii paziente come le larve raramente cooperano e spesso devono essere restituiti al punto di partenza molte volte prima che strisciano attraverso il campo.
8. Record di circa 10-15 minuti di ininterrotta riprese video digitali e ritagliare e rimuovere tutti i filmati inutili post-acquisizione digitale con software di editing video.

3. Imaging adulti Drosophila

1. Posizionare un singolo adulto Drosophila in un usa e getta da 1,5 ml spettroscopica polistirolo cuvetta.
   Nota: CO ₂ per l'anestesia di adulti Drosophila immediatamente prima di un Behavprotocollo di analisi ioral può compromettere i risultati ^12. Si raccomanda di adulti Drosophila disporre di un periodo di 24 ore per recuperare da CO ₂ l'anestesia prima di eseguire un test comportamentale ^13.
2. Inserire l'estremità della cuvetta con un piccolo batuffolo di cotone. Assicurarsi che il batuffolo di cotone è ricco abbastanza stretto per occupare il grande spazio tappo e limita la mosca al vano ridotto volume della cuvetta.
3. Inserire la cuvetta sul piatto bianco fase di un microscopio stereo e allineare correttamente il vano ridotto volume della cuvetta con il campo visivo osservata nel monitor LCD della fotocamera digitale.
4. Illuminare la cuvetta dall'alto con luce da un sistema di illuminazione a fibre ottiche. Regolare l'angolazione della luce incidente per fornire l'illuminazione ottimale.
5. Mettere a fuoco il microscopio e iniziare l'acquisizione di video digitale.
6. Record di circa 30-45 min di ininterrotta riprese video digitali e ritagliare e rimuovere tutto il superfluorepertorio post-acquisizione digitale con software di editing video.

Risultati

Abbiamo utilizzato con successo questa tecnica per acquisire e quantificare il fenotipo larvale comportamentale associata alla perdita di funzione del gene Stathmin (Figura 2) ^14. Il gene codifica per una proteina Stathmin normativo microtubuli che le partizioni dimeri di tubulina da pool di tubulina solubile, e si lega i microtubuli e promuove il loro smontaggio ^15,16. Funzione Stathmin è necessario per mantenere l'integrità dei microtubuli nelle assoni dei...

Discussione

Forza Drosophila melanogaster s 'come sistema modello per lo studio della funzione del sistema nervoso deriva in gran parte dalla convergenza dei potenti strumenti genetici disponibili e la vasta gamma di test comportamentali robusti sviluppato. Qui vi presentiamo una tecnica di microscopia semplice e ampiamente accessibili per l'acquisizione video digitale di alta qualità di Drosophila adulti e fenotipi locomotiva larvali da una prospettiva laterale. Abbiamo utilizzato con successo questo app...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trinocular Stereozoom Microscope	Olympus Corporation	SZ6145TR	½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount
1X C-mount	Leeds Precision Instruments	LSZ-1XCMT2
Digital Camera Coupler (43 mm thread)	Qioptiq Imaging Solutions	25-70-10-02
58 mm to 48 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR5848
48 mm to 43 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR4843
Lensmate Adapter Kit for Canon G10	LensMateOnline.com
Canon PowerShot G10 Digital Camera	Canon U.S.A., Inc.
1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette	Denville Scientific	U8650-4