Modelando o ciclo de vida do vírus Ebola Sob Nível de Biossegurança 2 condições com partículas semelhantes a vírus contendo Tetracistronic minigenomas

Resumo

Trabalho com vírus Ebola infecciosas é restrito a nível de biossegurança 4 laboratórios. Tetracistronic replicação e transcrição do vírus-competente como partículas contendo minigenoma (trVLPs) representam um sistema de modelagem do ciclo de vida que nos permite modelar com segurança múltiplos ciclos infecciosos sob nível de biossegurança 2 condições, baseando-se exclusivamente em componentes vírus Ebola.

Resumo

Vírus Ebola causar febres hemorrágicas graves em seres humanos e primatas não-humanos, com letalidade de até 90%. Não há vacinas aprovadas ou tratamentos específicos para a doença causada por estes vírus, e trabalhar com os vírus Ebola infecciosas é restrito a nível de biossegurança 4 laboratórios, limitando significativamente a investigação sobre estes vírus. Ciclo de vida de sistemas de modelagem modelo de ciclo de vida do vírus sob nível de biossegurança 2 condições; no entanto, até recentemente, esses sistemas têm sido limitados a tanto aspectos individuais do ciclo de vida do vírus, ou um único ciclo infeccioso. Minigenomas Tetracistronic, que consistem em vírus Ebola regiões não-codificadoras, um gene repórter, e três genes do vírus Ebola, envolvidos na morfogénese de brotamento, e entrada (VP40, GP _1,2, e VP24), pode ser usado para produzir a replicação e transcrição partículas -competent semelhantes a vírus (trVLPs) que contêm estas minigenomas. Estes trVLPs pode infectar continuamente células que expressam o Ebolaproteínas do vírus responsáveis ​​pela replicação do genoma e transcrição, o que nos permite modelar com segurança múltiplos ciclos infecciosos sob nível de biossegurança 2 condições. É importante notar que os componentes virais deste sistemas são exclusivamente derivados de vírus Ebola e não de outros vírus (como é, por exemplo, o caso em sistemas que utilizam vírus pseudotipados) e VP40, VP24 GP _1,2 e não são sobre-expresso neste sistema , tornando-a ideal para o estudo da morfogênese, a brotação ea entrada, apesar de outros aspectos do ciclo de vida do vírus, tais como replicação e transcrição do genoma também podem ser modelados com este sistema. Portanto, o ensaio trVLP tetracistronic representa o sistema de modelagem de ciclo de vida mais abrangente disponível para os vírus Ebola, e tem um tremendo potencial para uso na investigação da biologia do vírus Ebola no futuro. Aqui, nós fornecemos informações detalhadas sobre a utilização deste sistema, bem como sobre os resultados esperados.

Introdução

Vírus Ébola são o agente causador da febre hemorrágica grave em seres humanos e primatas não-humanos, com as taxas de mortalidade de até 90% em surtos em humanos ^1. Embora tenha havido progressos significativos nos últimos anos no desenvolvimento de vacinas, bem como tratamentos específicos (revisada em ^2,3), estes não são aprovados para uso humano. Partículas de vírus Ebola tem uma aparência em forma de rosca característica com um comprimento de cerca de 1 ^ m e um diâmetro de 96 a 98 nm ^{de 4.} Forma-se um núcleo do nucleocapsídeo das partículas virais e consiste em 1) o genoma não segmentado de cadeia simples de sentido negativo de ARN, que codifica os genes Ebolavirus 7 (Figura 1), 2) a nucleoproteína NP, que encapsidates o genoma, 3 ) do complexo de polimerase viral que consiste na polimerase L e seu co-factor VP35, e 4) o activador transcricional VP30. Além disso, foi recentemente mostrado que a proteína VP24 está também associada com nucleocápsides ^4. A nucleocápside está rodeado por o espaço da matriz em que a proteína de matriz de VP40, que é responsável pela morfogénese de viriões e gemulação, está localizado. Partículas de vírus são mais envolvido, e incorporado no envelope que é a única proteína de superfície GP _1,2, o qual é responsável pela ligação do virião e entrada.

Trabalho com vírus Ebola infecciosas deve ser realizada em um laboratório de contenção máxima no nível de biossegurança (BSL) quatro condições, o que restringe esse trabalho a algumas instalações em todo o mundo. A fim de estudar a biologia destes vírus ou o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, em condições BSL2, investigadores dependem quer por sobre-expressão de proteínas recombinantes do vírus Ebola, ou em sistemas de modelagem de ciclo de vida, os quais podem ser trabalhados com a ausência de vírus Ebola infecciosa. Recombinante de expressão de proteínas do vírus Ebola ou é alcançada a partir de plasmídeos de expressão ou de vectores virais. Um caso especial desta estratégia é ogeração de viriões ou partículas semelhantes a vírus com base em outros vírus do que os vírus Ebola (mais comumente retrovírus ou vírus da estomatite vesicular), na presença de forma recombinante expressa GP _1,2, conduzindo à geração de partículas pseudotipados, o qual pode ser utilizado para estudar o processo de entrada de filoviruses e tela de inibidores de entrada ^5. Alternativamente, os vírus recombinantes (por exemplo, vírus da estomatite vesicular) que codificam o vírus Ebola GP _1,2 em vez do seu próprio glicoproteína pode ser gerado e utilizado para estudar a entrada do vírus sob condições de nível de segurança 2 ^6.

Sistemas de modelagem de ciclo de vida são formas de sistemas de genética inversa que caracterizam a utilização de análogos truncados do genoma do vírus Ebola (minigenomas), que são produzidos inicialmente a partir de cDNA e depois replicados e transcritos por proteínas do vírus Ebola fornecidas em trans. O primeiro sistema minigenoma para o vírus Ebola foi desenvolvido há mais de 15 anos atrás ⁷, E uma vez que tem sido usado para estudar a replicação do genoma do vírus Ebola e a transcrição (revista em ^8,9). Neste sistema um minigenoma monocistrónicas consistindo de um único gene repórter flanqueado pelas regiões terminais não-codificantes do genoma do vírus Ebola (chamado o líder e reboque) (Figura 1) é expressa em células de mamífero (normalmente através de transcrição usando polimerase de RNA de T7) em conjunto com as proteínas virais L, VP35, VP30 e NP. O minigenoma está encapsidado pela NP, e, em seguida, replicado e transcrito pelas outras proteínas da nucleocápside, utilizando sinais de actuação cis localizadas no líder e reboque, levando a actividade repórter que reflecte estes dois aspectos do ciclo de vida do vírus (Figura 2).

De forma a modelar passos adicionais do ciclo de vida viral, transcrição e replicação competente partícula semelhante a vírus sistemas (trVLP) têm sido desenvolvidos, que são baseados em sistemas de minigenoma clássicos, mas apresentam o umexpressão dicional das outras proteínas virais VP24, VP40 e GP _1,2 de plasmídeos de expressão ^10,11. A presença de VP40 conduz à formação de trVLPs, que suportará GP _1,2 na sua superfície, e realizar uma nucleocápside contendo minigenoma no interior. Estes trVLPs pode ser utilizado para infectar as células-alvo, que foram ambos pretransfected com plasmídeos de expressão de L, VP35, VP30 e NP, a fim de facilitar a replicação e transcrição de minigenomas trazidos para dentro das células alvo dentro trVLPs ^11, ou são células alvo ingénuos (isto sem expressão orientada por plasmídeo de proteínas do vírus Ebola) ^10. Isto resulta na actividade repórter nas células-alvo, o que reflecte a replicação dos minigenomas no células produtoras, a morfogénese e brotação de trVLPs, a sua entrada nas células alvo, e 1), no caso das células-alvo do genoma, também pretransfected replicação e transcrição secundários ( ou seja, a transcrição por proteínas virais produced em células-alvo) nas células alvo, ou 2) no caso das células-alvo também ingénuos primária de transcrição (ou seja, a transcrição por proteínas virais trazidos para dentro de células-alvo trVLPs) (Figura 3). É importante notar que estes sistemas só têm sido usados ​​para modelar um único ciclo de infecção, e contam com a sobre-expressão de todas as proteínas virais, que no caso de VP24 e VP40 é particularmente problemático, uma vez que estas proteínas têm mostrado ser fortes reguladores negativos da replicação do genoma e quando superexpresso transcrição a partir de plasmídeos ^12,13. Além disso, os preparativos trVLP produzidos nestes sistemas contêm uma elevada proporção de partículas não infecciosas, colocando desafios para a análise bioquímica do trVLPs infecciosas ^14.

A fim de superar estes problemas, desenvolvemos recentemente um sistema de minigenoma tetracistronic que, para além de um gene repórter, também contém os genes que codificam para VP40, _1,2 e GPVP24 (Figura 1). Semelhante ao sistema de minigenoma monocistrónicas clássica, este sistema acarreta a produção de trVLPs que podem infectar as células-alvo (Figura 4) ^15. No entanto, em contraste com o sistema clássico de minigenoma, VP40, GP _1,2, e VP24 são produzidas após a transcrição do genoma viral em vez de ser sobre-expressa a partir dos plasmídeos. Como resultado, a cinética e os níveis de expressão destas proteínas muito mais intimamente imitar os encontrados durante o ciclo de vida viral e, consequentemente, o rácio de infeccioso para trVLPs não infecciosas é aumentada cerca de 500 vezes no presente sistema ^15. Além disso, a utilização deste sistema foi possível continuamente passagem trVLPs contendo minigenoma tetracistronic, modelando múltiplos ciclos infecciosas. Como tal, trVLPs tetracistronic Atualmente o sistema de modelagem de ciclo de vida mais abrangente disponível para estudar a biologia do vírus Ebola em condições BSL2. Aqui, nós fornecemos informações detalhadas sobre o uso of este sistema, assim como os resultados esperados.

Protocolo

1 Divisão de células produtoras de produção inicial de trVLPs

1. Remova o meio 80-90% confluentes células 293 cultivadas em 75 ^cm2 em frascos de alta glucose do meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, e 1x pen / estrep (DMEM10 ). Lave as células duas vezes com 10 ml de solução salina de fosfato tamponada (PBS), tendo o cuidado para não deslocar as células, e adicionar 2 ml de tripsina-EDTA para as células.
2. Incubar as células à temperatura ambiente até que as células mostram arredondamento significativo quando observados sob um microscópio (de cerca de 30 seg). Desalojar células por frasco tocando, e adicionar 8 ml DMEM10. Absolutamente ressuspender as células suavemente pipetando para cima e para baixo, até uma suspensão de células isoladas é observado quando visto ao microscópio.
3. Contar as células utilizando um contador de células automatizado. Dilui-se as células para 2 x 10 ⁵ células por ml em DMEM10. Pipeta de 2 ml de suspensão celular por poço em placas de 6 poços (4 x 105 células por poço).
4. Incubar as placas em uma incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C com 5% de CO _2.

2 A transfecção de células produtoras de produção inicial de trVLPs

1. 24 horas após a divisão das células (ver Figura 5 para obter uma visão geral do tempo da experiência), pipeta plasmídeo DNA ¹⁵ (para valores ver Tabela 1) para um estéril 2 ml cryovial utilizando a ponta dos filtrados. Adicionam-se 100 ul por poço de OptiMEM com o ADN. Vortex a mistura brevemente e suavemente girar os tubos utilizando uma microcentrífuga. Se vários poços estão a ser transfectada com plasmídeos idênticos, um mastermix para vários poços pode ser feito.
2. Resumidamente vortex o frasco com a Transit LT1 antes do uso. Adicionar 7,5 mL de trânsito LT1 por poço para o ADN diluído. Vortex suavemente a mistura, tendo o cuidado de não recolher líquido na tampa do frasco de congelação, e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
3. Misture delicadamente a transfecçãocomplexo pipetando para cima e para baixo. Adicionam-se 100 ul dos complexos de transfecção, gota a gota a cada poço. Balance o prato para frente / trás e para os lados para distribuir os complexos de transfecção. Não rode a placa, pois isso vai causar desigual difusão dos complexos de transfecção.
4. Retorne as células para a incubadora.
5. Após 24 horas, remover o sobrenadante a partir de células. Adicionar 4 ml de DMEM com 5% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1x pen / estrep (DMEM5) para as células. Este passo pode ser feito para cima de 3 poços de uma vez, sem a secagem dos poços, assumindo que os poços contêm amostras idênticas (de outro modo, devido à natureza auto-amplificação das trVLPs neste sistema, a contaminação cruzada pode tornar-se um problema e este passo deve ser feito um poço de cada vez).
6. Retorne as células para a incubadora.

3 Preparação de Células Alvo

1. Dividir 293 como descrito na seção 1, semeando 4 x 10 ⁵ células em 2 ml DMEM10 por poço de umaPlaca de 6 poços.
2. 24 h depois da separação das células alvo e 24 horas antes da infecção, as células alvo transfecção como descrito na secção 2, utilizando o ADN ascende na Tabela 1, e 4,5 mL por poço Trânsito LT1.

4. infecção das células-alvo e colheita de células produtoras

1. Transfira os sobrenadantes das células produtoras de tubos de 15 ml. Retire e descarte qualquer sobrenadante restante usando uma mangueira de vácuo. Adicionar 250 ul de tampão de lise Glo para as células.
2. Sobrenadante Centrifugar durante 5 minutos a 800 x g e à temperatura ambiente para eliminar as amostras de detritos celulares.
3. Retirar o sobrenadante a partir de um poço de células alvo. Adicione cuidadosamente 3 ml de apuradas sobrenadante de células produtoras de células alvo, utilizando a menor velocidade de pipeta. Evitar pipetando directamente sobre as células, a fim de evitar a ruptura da monocamada de células. Este passo deve ser feito um poço de cada vez.
4. Quando todas as amostras terem sido transridos, o retorno das células-alvo para a incubadora para permitir a sedimentação dos trVLPs e infecção de células alvo.
5. Após 15 min de incubação à temperatura ambiente no tampão de lise Glo, voltar a suspender as células produtoras em tampão de lise utilizando uma micropipeta ajustado para 150 mL, e transferir a amostra para um criotubo de 2 mL. Neste momento, os lisados ​​podem ser congeladas a -80 ° C, ou medido directamente, tal como descrito na secção 6.
6. 24 horas após a infecção, remover o sobrenadante a partir de células alvo. Adicionar 4 ml DMEM5 por poço para as células. Este passo pode ser feito por até três poços ao mesmo tempo, se os poços contêm amostras idênticas (de outra forma, devido à natureza auto-amplificação das trVLPs neste sistema, a contaminação cruzada pode tornar-se um problema, e este passo deve ser feito um poço de cada vez).

5. Colheita de células-alvo para a Infecção ciclo único

1. Se apenas um único ciclo de infecção devem ser avaliadas, em 72 horas após a infecção remove tele sobrenadante das células alvo, utilizando um tubo de vácuo.
2. Colher as células em 250 mL de tampão de lise Glo conforme descrito na seção 4 para células produtoras.

6. Colheita de células alvo e Passaging contínua de trVLPs

1. Se trVLPs são continuamente passadas, preparar um novo grupo de células alvo, tal como descrito na secção 3 de modo a que eles estão prontos para a infecção de 72 h após a infecção do primeiro conjunto de células alvo (ver Figura 5).
2. Infect o novo conjunto de células alvo, tal como descrito no ponto 4 (usando o primeiro conjunto de células alvo, em lugar das células produtoras).
3. Repita essas etapas a cada 72 horas.

7 Análise Repórter de Actividade

1. Se os lisados ​​de células foram congeladas, o descongelamento à temperatura ambiente. Certifique-se de que as amostras tenham atingido a temperatura ambiente antes da medição.
2. Descongelar a quantidade necessária (40 ul por amostra) de tampão de ensaio de Renilla Glo (i idealmente congeladon alíquotas) à temperatura ambiente. Certifique-se de que o buffer atingir a temperatura ambiente antes da medição.
3. Adicione 1/100 ^º volume de substrato Renilla Glo para o tampão de ensaio Renilla Glo obter reagente Renilla Glo, e misturar em vortex. Pipetar 40 ul de reagente de Renilla Glo em um de 96 poços branca placa.
4. Adicionar 40 ul de amostra com o reagente de Renilla-Glo. Espere 10 min, em seguida, medir as amostras em um luminometer utilizando um tempo de integração de 1 segundo.

Resultados

A transfecção de células 293 produtores com plasmídeos de expressão que codifica as proteínas do vírus Ebola nucleocapsídeo NP, VP35, VP30, e L, um minigenoma tetracistronic e os acessórios T7 resultados polimerase em minigenoma replicação e transcrição e atividade repórter que é facilmente detectável em 72 horas (Figura 6 ). É importante notar que a actividade repórter observado (10 ^5,6 unidades de luminescência relativa (RLU)) excede a de um controlo negativo em que o plasmídeo de expressão que codifica L foi omitido da transfecção (10 ³ RLU) por mais do que 2 logs. O baixo nível de actividade observada mesmo na ausência de L é provavelmente devido a um promotor críptico no plasmídeo de minigenoma. As células alvo infectadas com trVLPs partir do sobrenadante de células produtoras realmente apresentam níveis de actividade repórter ligeiramente aumentada quando comparada com células produtoras, e alcançar valores entre 10 ⁶ e 10 ⁷ RLUs, dependendo da passagem. Em contraste, wuando o sobrenadante de células produtoras de controlo -L se subculturas em células alvo (que expressam toda a proteína da nucleocápside, incluindo L), a actividade repórter não exceda o ruído do luminómetro (cerca de 10 RLU ²⁾ de fundo.

O ensaio trVLP tetracistronic pode ser utilizado para estudar o ciclo de vida do vírus Ebola. Por exemplo, a infecção de células 293 com trVLPs é dependente da presença de factores de fixação, tais como Tim-1 ^16, o qual tem de ser fornecida em trans nestas células. Por conseguinte, num ensaio de trVLP tetracistronic uma queda na actividade repórter nas células-alvo de cerca de 100 vezes é observado na ausência de Tm-1 (Figura 7A). O papel das proteínas específicas (virais ou celulares) no ciclo de vida do vírus também pode ser avaliada utilizando a tecnologia de ARNi em conjunto com esta abordagem. Como um exemplo, ARNi mediado regulação descendente dos resultados L em uma queda na actividade repórter de cerca de 100 vezes, o que reflecte o papel fundamental de L emreplicação e transcrição (Figura 7B) ^7. Além disso, é possível manipular directamente o minigenoma de avaliar o efeito de mutações no ciclo de vida do vírus. Como um exemplo, quando VP24-expressão do minigenoma é abolida através da introdução de três codões de paragem imediatamente a jusante do codão de iniciação, a actividade repórter nas células produtoras não é alterada drasticamente; contudo, a actividade repórter nas células-alvo é reduzida em cerca de 20 vezes após uma passagem, e de 400 vezes após duas passagens, o que indica um papel de VP24 na produção de trVLPs infecciosos (Figura 7C) ^15.

Figura 1 Estrutura do genoma do vírus Ebola, assim como minigenomas monocistrónicas e tetracistronic. Regiões para a proteína do vírus Ebola codificação são mostrados como vermelho (NP,VP35, VP30, e L), amarelo (VP40 e VP24) ou azul (GP _1,2) caixas. Regiões não codificante (NCRs) são mostrados em verde, com as regiões líder e reboque indicados. O subscrito indica que NCR viral foi usado para unir as regiões de codificação. A região de codificação para o repórter (REP) é mostrado em roxo.

Figura 2 Ensaio de minigenoma monocistrónicas. Células são transfectadas com os plasmídeos de expressão para as proteínas da nucleocápside do vírus Ebola (NP, VP35, VP30, L), de um minigenoma monocistrónicas (mg) e a polimerase de T7. O minigenoma é inicialmente transcrita pela polimerase de T7 (a) para dentro de um RNA de minigenoma unencapsidated na mesma orientação do genoma viral (ARNv), que é então encapsidado pela NP (b). Este encapsidado ARNv é replicado por meio de um RNA de minigenoma complementar (cRNA) intermediate (c), e, em seguida transcrita em mRNAs repórter (d) que são traduzidos em proteína repórter (e).

Figura 3. ensaio trVLP com um minigenoma monocistrónicas. Células são transfectadas com os plasmídeos de expressão para as componentes do ensaio de minigenoma (as proteínas da nucleocápside do vírus Ebola NP, VP35, VP30, L, um minigenoma monocistrónicas e a polimerase de T7), bem como VP40, _um GP _{, 2} e VP24. Isto leva à formação de trVLPs que incorporam nucleocápsides contendo minigenoma (f). Estes trVLPs pode infectar as células-alvo (g), que são ou pretransfected com plasmídeos de expressão para NP, VP35, VP30, e L (em cima), o que resulta em replicação e transcrição secundários (d), que conduz a expressão de repórter (e), ou ingénuo células-alvo (em baixo), resultando na transcrição primária da minigenomes (h), também levando a expressão repórter (e).

Figura 4. ensaio trVLP com um minigenoma tetracistronic. Células são transfectadas com os plasmídeos de expressão para as proteínas da nucleocápside do vírus Ebola (NP, VP35, VP30, L), de um minigenoma tetracistronic (mg) e a polimerase de T7. Transcrição inicial (a), a encapsidação (b), a replicação do genoma (c) e de transcrição (d), bem como a tradução (e) ocorrer num ensaio de minigenoma monocistrónicas. No entanto, para além de ARNm repórter, os mRNAs para VP40, VP24 GP _1,2 e são também transcrito a partir do minigenoma tetracistronic, resultando na formação de trVLPs (f). Estes trVLPs infectar as células-alvo que foram pretransfected com os plasmídeos de expressão para as proteínas da nucleocápside NP, VP35, VP30 e L, bem como o vírus Ebola celularfactor de fixação Tim-1, resultando na replicação do genoma e da transcrição, e a produção de trVLPs que podem ser utilizados para infectar células alvo frescos.

Figura 5 Tempo de um ensaio trVLP tetracistronic por 3 passagens consecutivas. Os dias de células de sementeira (s), a transfecção de células (t), infectando as células (i), troca de meio (c) e a colheita de células e trVLPs (h) são indicada por três passagens consecutivas (indicado pelas setas).

Figura 6 níveis típicos da atividade de repórter observada em um ensaio trVLP tetracistronic. Um ensaio trVLP tetracistronic foi realizada ao longo de 5 passagens seguindo o protocolool descrito neste artigo. Como um controlo negativo, o plasmídeo de expressão que codifica L foi omitido (-L) a partir da transfecção de células produtoras p0. As células alvo em passagens P1 a P5 foram transfectadas com os plasmídeos de expressão para todas as proteínas da nucleocápside, incluindo L. O ruído de fundo é o luminómetro indicadas como uma linha tracejada. Médias e desvios-padrão de 4 repetições biológicas de três experimentos independentes são mostrados.

Figura 7 Avaliando o impacto de vários fatores virais e celulares no ciclo de vida viral usando trVLPs tetracistronic. (A) Tim-1 como um factor de fixação. Células alvo que foram pretransfected com plasmídeos de expressão que codificam para as proteínas da nucleocápside e com ou sem um plasmídeo que codifica para Tm-1 (descrito em ¹⁵⁾ foram infectados com tettrVLPs racistronic. 72 hr atividade repórter infecção pós em células alvo p1 foi determinada. As médias e desvios-padrão de 4 repetições biológicas de quatro experimentos independentes são mostrados. (B) Efeito do RNAi knockdown de L na replicação do genoma e transcrição. Células-alvo que foram pretransfected com plasmídeos de expressão para os componentes nucleocapsídeo, tim-1 e miRNAs contra L (anti-G) ou uma proteína não relacionada (anti-GFP) (descrito em ¹⁵⁾ foram infectados com trVLPs tetracistronic. 72 hr atividade repórter infecção pós em células alvo p1 foi determinada. As médias e desvios-padrão de cinco repetições biológicos de dois experimentos independentes são mostrados. (C) Efeito de mutações no minigenoma em trVLP infectividade. Um ensaio trVLP tetracistronic foi realizado usando um tipo selvagem minigenoma (4cis-WT) ou um minigenoma em que três codões de paragem foram introduzidos imediatamente após o codão de iniciação de VP24, que suprime o expressandof esta proteína, mas introduzindo apenas mudanças mínimas para o minigenoma em relação ao comprimento, composição de ácido nucleico, estruturas secundárias etc atividade Reporter em P0, P1 e P2 foi medida 72 horas após a transfecção / infecção. Médias e desvios padrão de três repetições biológicas de três experimentos independentes são mostrados.

	Células produtoras (P0)	As células-alvo (P1 e superior)
pCAGGS-NP	125	125
pCAGGS-VP35	125	125
pCAGGS-VP30	75	75
pCAGGS-L	1000	1000
p4cis-vRNA-RLuc	250	-
pCAGGS-T7	250	-
pCAGGS-Tim1	-	250

Tabela 1 de ADN equivale a transfecção. A quantidade de cada um dos plasmídeos necessários para a transfecção de células produtoras e alvo é mostrado em ng por poço de uma placa de 6 poços. Todos os plasmídeos estão descritos em Watt et al ^15.

Discussão

O ensaio trVLP tetracistronic descrito neste manuscrito permite a modelagem do ciclo de vida do vírus da Ebola ao longo de vários ciclos infecciosos. É importante ressaltar que os trVLPs produzidas neste sistema, não contêm a informação genética para as proteínas nucleocapsídeo NP, VP35, VP30, e L, que juntos compõem quase 60% do genoma do vírus Ebola e são essenciais para a replicação viral. Em vez disso, estas proteínas têm que ser fornecidos em células alvo em trans a partir de plasmídeos de expressão, e qualquer infecção de células que não expressam todas as 4 dessas proteínas é abortada. É importante notar que não existe qualquer evidência de recombinação genética para filovírus, e não existem regiões homólogas partilhadas entre o minigenoma tetracistronic e os plasmídeos de expressão para as proteínas da nucleocápside. Portanto, não há qualquer evidência prática nem qualquer base teórica que poderia prever a possibilidade de geração de corpo inteiro genomas do vírus Ebola, que poderia potencialmente resultar ema produção de vírus Ebola infecciosos, tornando este sistema seguro para o uso sob condições de BSL2.

Existem dois passos críticos no ensaio trVLP tetracistronic que são influenciados pelas condições experimentais, ou seja, a produção de trVLPs, e a infecção das células alvo com estes trVLPs. Produção de trVLPs é dependente de níveis elevados de replicação e transcrição de minigenoma, o qual por sua vez é dependente de uma elevada eficácia de transfecção. A transfecção eficácia pode ser facilmente avaliada através da inclusão de um controlo-L, em que o plasmídeo de expressão para L é trocado por um plasmídeo de expressão que codificam eGFP. Taxas de transfecção nestas condições deve ser superior a 50% por inspeção com um microscópio de fluorescência 24 horas após a transfecção. Além disso, as células têm que ser livres de micoplasma, uma vez que em nossa experiência micoplasma contaminação prejudica drasticamente a replicação e transcrição minigenoma (dados não publicados). Devido a sua alta transfectabilidade 293 cells são a linha de células de escolha para os ensaios trVLP; no entanto, estas células são relativamente pouco sensíveis (embora não completamente refração) a infecção com o vírus Ebola ^16. Expressão de um factor de fixação, tais como Tim-1 aumenta a infecção de células 293 com trVLPs cerca de 100 vezes, e é crucial para o sucesso deste sistema ao longo de várias passagens.

Enquanto trVLPs tetracistronic não são auto-replicante por conta própria, eles são auto-replicante em células que expressam as proteínas nucleocapsídeo. Como tal, as precauções têm de ser feitas para evitar contaminações cruzadas entre os poços que contêm diferentes trVLPs (por exemplo, com diferentes mutações no minigenoma). De um ponto de vista mais técnico, devido à grande diferença entre sinais positivos e negativos neste ensaio (cerca de 4 toras), conversa cruzada entre as amostras em que a medição da actividade da luciferase pode ser um problema; no entanto, esta pode ser facilmente evitada, deixando uma cavidade vazia entre cada uma das amostras noPlaca de 96 poços utilizados para medir a actividade da luciferase.

Há uma infinidade de aplicações possíveis para trVLPs tetracistronic. Obviamente, eles estão bem adaptados para estudar a entrada de partículas filovírus, desde trVLPs infecciosas tem a estrutura típica do tipo fio de filovírus infecciosas ^14, e contêm os mesmos componentes como partículas virais filovírus. É importante notar que não contêm componentes de outros vírus, como é o caso quando se utiliza pseudotipados viriões ou partículas semelhantes a vírus, tais como partículas de retrovírus que ostentam GP _1,2, ou de vírus recombinantes, tais como recombinantes de vírus da estomatite vesicular que expressam GP _1,2 . A necessidade de factores de fixação 293 quando se usa células como células alvo, neste sistema pode ser explorada para a tela e para investigar o papel de tais factores de fixação, enquanto que as funções de outros factores celulares, tais como os envolvidos na replicação do genoma e transcrição, bem como morfogênese e brotoding, pode ser investigado utilizando a tecnologia de RNAi. O efeito de mutações em proteínas virais no ciclo de vida do vírus pode também ser estudado, ainda tem de se ter em mente que, enquanto VP40, GP _1,2, e VP24 são expressas após a transcrição virai, a expressão de outras proteínas virais é alcançada a partir da expressão plasmídeos, de forma que, devido a efeitos da sobre-expressão destas proteínas têm de ser tidas em conta. Além disso, deve ser tomado cuidado para que as mutações no minigenoma não alteram significativamente a duração do minigenoma, desde que a atividade repórter é diretamente afetado pela minigenoma comprimento ^15. Finalmente, uma vez minigenomas tetracistronic são análogos genoma viral que carregam genes virais e são replicados pelo complexo polimerase viral, também deve ser possível estudar a evolução desses genes em resposta a mutações em condições BSL2. Assim, embora mais estudos ainda são necessários nesse sentido, deve ser possível, por exemplo, a introdução abaixo do idealMutações em genes dentro dos minigenoma e depois trVLPs passagem até mutações cortesia emergir.

Uma limitação do ensaio trVLP tetracistronic que tem de ser mantido em mente é o facto de que, embora a maioria dos modelos de ciclo de vida do vírus, a transcrição primária em células alvo não é modelado por este sistema, uma vez que as células alvo tem que expressam as proteínas da nucleocápside de trans para que os trVLPs replicar. Se a transcrição primária tem de ser avaliado, é possível a utilização de células-alvo ingênuas ^10; no entanto, neste caso não replicação do genoma ocorre em células-alvo, e não mais trVLPs infecciosas são produzidos, abortando a infecção. Este é um problema principais que não pode ser ultrapassada sem tornar as trVLPs completamente auto-replicante, incluindo os genes para as proteínas da nucleocápside na minigenoma, o que, de facto, transformá-los em vírus Ebola recombinantes infecciosos. Na verdade, Ebolum vírus que expressam luciferase ou outros repórteres ter sido gerado e pode ser utilizada para avaliar e estudar a replicação e transcrição do genoma ^17,18; no entanto, a sua utilização é restrita a laboratórios BSL4. Além disso, tem que ser mantido em mente que, enquanto VP40, GP _1,2, e VP24 são expressos a partir de um análogo do genoma viral, a sua posição no minigenoma (2 ^ª, 3 ^ª, 4 ^ª e unidade de transcrição) não é idêntica à a sua posição no genoma do vírus (3 ^º, 4 ^º, e ⁶ de unidade de transcrição), o que poderia influenciar os seus níveis de expressão absolutas, assim como os seus níveis de expressão relativos em relação uns aos outros.

No geral, o ensaio trVLP tetracistronic representa o sistema de modelagem de ciclo de vida mais abrangente para os vírus Ebola disponíveis até à data, e permite a modelagem da replicação do genoma e transcrição, partícula morfogênese e brotação, bem como apego e entente em células alvo ao longo de vários ciclos infecciosos. Como tal, tem um grande potencial para a utilização em investigar a biologia do vírus Ebola, sob condições BSL2.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
75 cm2 Cell culture flask	Corning	430641
DMEM	Sigma	D6546	preheat to 37 °C prior to use
FBS	Life Technologies	26140-079	heat inactivate 30 min @ 56 °C
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	100x
Pen/strep	Life Technologies	15070-063	100x
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056
PBS			8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature
6-well Plates	Costar	3516
Opti-MEM I	Life Technologies	31985-070
Transit LT1	Mirus	MIR 2300
Glo lysis buffer	Promega	E2661
Renilla Glo luciferase assay system	Promega	E2720
96-well Assay plate (white)	Costar	3912
Modulus microplate luminometer	Turner Microsystems	998-9300