Un método para la selección de aptámeros Estructura de conmutación Aplicado a una de nanopartículas de oro ensayo colorimétrico

Resumen

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Resumen

Las moléculas pequeñas proporcionan blancos ricos para aplicaciones de biosensores debido a sus implicaciones fisiológicas como biomarcadores de diversos aspectos de la salud humana y el rendimiento. Aptámeros de ácido nucleico que se han aplicado cada vez más como elementos de reconocimiento en las plataformas de biosensores, pero la selección de aptámeros hacia blancos pequeños de moléculas requiere consideraciones especiales de diseño. Este trabajo describe la modificación y pasos críticos de un método diseñado para seleccionar la estructura de conmutación de aptámeros a blancos pequeños de moléculas. Secuencias de unión a partir de una biblioteca de ADN hibridado con sondas de captura de ADN complementarias sobre perlas magnéticas se separan de nonbinders a través de un cambio inducido diana en la conformación. Este método es ventajoso debido a secuencias de unión a la matriz de soporte (perlas) no se amplifican aún más, y que no requiere la inmovilización de la molécula diana. Sin embargo, la temperatura de fusión de la sonda de captura y la biblioteca se mantiene en o ligeramente por encima de RT, tales que las secuencias tdehybridize sombrero basado en la termodinámica también estará presente en la solución sobrenadante. Esto limita efectivamente la eficiencia de partición (capacidad de objetivo separado secuencias de nonbinders vinculante), y por lo tanto muchas rondas de selección será necesario para eliminar las secuencias de fondo. El método descrito se diferencia de anteriores selecciones aptámero estructura de conmutación debido a la aplicación de los pasos de selección negativa, el seguimiento de enriquecimiento simplificado, y la extensión de la longitud de la sonda de captura después del enriquecimiento de selección para proporcionar una mayor rigurosidad. Los aptámeros de la estructura de conmutación seleccionados son ventajosos en una plataforma de ensayo de nanopartículas de oro que informa de la presencia de una molécula diana por el cambio conformacional del aptámero. El ensayo de nanopartículas de oro se aplicó, ya que proporciona una rápida lectura simple, colorimétrico que es beneficioso en un entorno clínico o desplegado. Diseño y optimización de consideraciones se presentan para el ensayo como prueba de principle trabajo en tampón para proporcionar una base para una mayor extensión de la obra hacia la pequeña molécula de biosensores en fluidos fisiológicos.

Introducción

Las moléculas pequeñas han sido reconocidos como jugar papeles vitales en diversos procesos biológicos tales como la toxicidad fisiológica o de nutrición, la señalización celular, y los tratamientos farmacéuticos como a la enfermedad ^1. Varias moléculas pequeñas también se han sugerido como biomarcadores indicativos de las condiciones fisiológicas, incluyendo el estrés ^2,3, fatiga ^{4, 5} y la enfermedad. Por ejemplo, los niveles elevados de cortisol se correlacionan con el estrés que puede resultar en la disminución de rendimiento fisiológico y otras condiciones de salud ^6-8. Del mismo modo, las variaciones en las proporciones de ciertos péptidos en la saliva son predictivos de la fatiga, donde manifestaciones fisiológicas incluyen la falta de concentración, tiempo de reacción deteriorada, y la reducción de la función cognitiva ^4. Por lo tanto, el desarrollo de biosensores objetivo específico para controlar los niveles de moléculas pequeñas puede proporcionar una métrica muy valiosa para la evaluación de las capacidades de salud y el rendimiento de un individual.

Históricamente, la detección de molécula pequeña se ha realizado mediante técnicas de separación de trabajo intensivo o por el reconocimiento basada en anticuerpos ^6,7. Más recientemente, aptámeros de ácido nucleico ^9,10 han surgido como elementos de reconocimiento que poseen ventajas sobre los anticuerpos en aplicaciones específicas. Con su capacidad para unirse a una diana que varían en tamaño de iones metálicos ¹¹ a los tejidos ^12, aptámeros se han aplicado ampliamente como elementos de reconocimiento en las plataformas de biosensores ^13,14. En comparación con los anticuerpos, los aptámeros son sintetizados químicamente, y por lo tanto es fácil de introducir modificaciones químicas reproducibles para la inmovilización o la presentación de informes superficie. Los aptámeros pueden ser seleccionados con alta especificidad diana en las condiciones deseadas mediante la modificación de las condiciones de selección utilizados, mientras que los anticuerpos se limitan a las condiciones fisiológicas ^15,16. Además, los aptámeros son capaces de una mayor densidad de ligando debido a thEIR menor tamaño, lo que resulta en una mayor eficiencia de destino de señalización en una plataforma biosensor, y la mayor estabilidad de los aptámeros permite el uso repetido y almacenamiento del sensor a largo plazo ^16.

Los aptámeros se generan utilizando un procedimiento conocido como SELEX, en el que una biblioteca inicial de secuencias se evolucionó a partir de 10 ¹³ -10 ¹⁵ moléculas únicas a un grupo final enriquecido que contiene varios (10 ¹ -10 ²⁾ secuencias con potencial para unirse a la molécula diana. El grupo final enriquecido continuación, se secuencia, y las constantes de disociación _(Kd) se obtienen a partir de ensayos de las secuencias de mayor número de copia de unión con la molécula diana. Evolución de la piscina a una población final enriquecida se realiza un seguimiento mediante la supervisión del porcentaje de la piscina de unión a la diana en cada ronda, hasta que se obtiene un enriquecimiento máximo. Esto se lleva a cabo a través de una serie de rondas de evolución, donde las secuencias de unión se particionan de nonbinders y amplified utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La posibilidad de particionar con eficacia y retener aglutinantes es uno de los principales determinantes de la eficiencia de la selección y afecta directamente a las características de los aptámeros seleccionados ^15. La etapa de partición SELEX es más difícil para las moléculas pequeñas, ya que no poseen el tamaño o la variedad de grupos funcionales que ayudan al proceso de partición de dianas proteicas ^1,15. Por ejemplo, muchas plataformas de separación de proteínas se basan en el tamaño o separación basada en carga, sin embargo las propiedades de los complejos diana molécula de ADN de pequeña consolidados generalmente no son significativamente diferentes que la de las secuencias no vinculantes, resultando en partición ¹ ineficaces. Los métodos alternativos de separación de SELEX pueden implicar la inmovilización o el etiquetado del objetivo, lo que potencialmente altera las características de unión de una molécula pequeña. En consecuencia, el diseño de un proceso de selección para generar aptámeros para la pequeña molécula dirige requires consideración especial.

Una variedad de modificaciones se han aplicado a la metodología original SELEX para mejorar la eficiencia del procedimiento de partición, mejorar la afinidad o especificidad de las secuencias en la piscina final, o hacerlo más susceptible a diferentes aplicaciones ^15,16. Una modificación SELEX capaz de seleccionar para las pequeñas moléculas fue diseñado para generar la estructura de conmutación de aptámeros, o aptámeros que se someten a un cambio conformacional tras la interacción con la molécula diana ^17,18. En un ejemplo de este método, la biblioteca se hibrida con una pieza corta de ADN complementario no vinculante (ADNc) inmovilizada sobre perlas magnéticas ^17. Tras la unión a la diana, el cambio conformacional de secuencias de unión les permite dehybridize a partir del ADNc, la liberación de ellos en la solución sobrenadante, mientras que los restantes nonbinders hibridaron con el ADNc / perlas se repartió magnéticamente y se descartan. Este método es advantajosa para las pequeñas moléculas, ya que no requiere la inmovilización o el etiquetado de la molécula diana para conseguir la separación.

Los aptámeros que son capaces de estructura de conmutación poseen una característica valiosa para cualquier plataforma biosensor potencial que requiere un cambio en la estructura aptámero para detectar la presencia de una molécula diana. Específicamente, los aptámeros se pueden combinar con nanopartículas de oro (AuNPs) para crear ensayos que función basada en el principio de estructura de conmutación para producir una respuesta colorimétrica en presencia de molécula diana después del desafío sal ^19,20. En un ensayo de AUNP, el aptámero de ADN de cadena sencilla (ssDNA) adsorbe inicialmente a la superficie AUNP y lo protege de desafío sal. La presencia de la diana induce un cambio conformacional en el aptámero que expone la superficie AUNP, resultando en un cambio de color de rojo a azul después de la adición de sal. AUNP ensayos también se han demostrado para amplificar la señal, donde aptámero afinidad micromolars puede detectar objetivos a nivel órdenes de magnitud menor que la constante de disociación (K _d) ^21. Esta característica es especialmente atractivo para las pequeñas metas molécula, afinidades donde normalmente van desde bajo micromolar a concentraciones milimolares ^1,15. Generalmente, el ensayo también es rápida y relativamente sencilla de realizar, fomentando el estudio adicional de ensayos de aptámero-AUNP como plataformas de detección de biosensor.

El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo universal para la selección de aptámeros estructura de conmutación de pequeñas moléculas para aplicaciones de biosensores utilizando el cortisol marcador de estrés como una molécula representativa. Un esquema de detección biosensor AUNP es de interés debido a su simplicidad de operación y lectura colorimétrica, pero aptámeros estructura de conmutación son aplicables a los productos de plataforma de detección alternativos, como la electroquímica ²² o fluorescencia ²³ que también proporcionan la detección a través de un cambio en conformatio aptámeron al objetivo vinculante. Comparado con los métodos anteriores, múltiples pasos de selección negativos se incorporaron en el diseño ^17,18, y un esquema simple de detección de enriquecimiento basado en UV se implementó (Figura 1). Este protocolo está en contraste con el esquema de detección de enriquecimiento de radioligando utilizado en métodos heredados ^17. El método propuesto también incorporó un aumento en la longitud de las sondas de captura de ADNc utilizados en la selección para aumentar la eficiencia y eficacia de partición sintonizar la rigurosidad de la selección después se observó enriquecimiento máxima ^24. El plomo rigurosidad sintonizado a un porcentaje total menor de ADN eluido por el objetivo en la piscina final, pero resultó en mayor número de copias de una secuencia que se unían con afinidad mejorada en comparación con la secuencia de número de copia alto de la ronda anterior. La secuencia de número de copia alto de la piscina final se aplica a un ensayo AUNP para ilustrar que la secuencia era susceptible de una plataformaeso requiere un cambio estructural para indicar objetivo vinculante. Este tampón de ensayo basado muestra que la respuesta del ensayo AUNP se puede modificar cambiando la densidad de ADN aplicado a la superficie, y sirve como prueba de principio de trabajo de dedicar futuros esfuerzos de investigación hacia el desarrollo de moléculas pequeñas biosensores AUNP a base de aptámero en fluidos fisiológicos.

Protocolo

1. Biblioteca y Primer Diseño y Síntesis

1. Diseñar la biblioteca inicial y cebadores (este tema se ha revisado ampliamente en publicaciones anteriores) ^25,26.
   1. Sintetizar las siguientes secuencias de este estudio usando química de fosforamidita estándar:
      Biblioteca: GAATGGATCCACATCCATGG-N ₄₀ -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA
      Cebador: GGAATGGATCCACATCCATGG
      Cebador inverso: Biotina-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA
   2. Diseño de las sondas de captura de cDNA para ser complementaria a la región 5 'de la biblioteca. Elige la longitud inicial por análisis de software temperatura de fusión en línea para proporcionar una temperatura de fusión ligeramente por encima de RT, con cada base posterior suministro de un aumento de la temperatura de fusión.
      Captura mer sonda: CCATTCC-biotina
      mer sonda de captura: TCCATTCC-biotina
      mer sonda de captura: ATCCATTCC-biotina
2. Purificar la biblioteca por HPLC estándar. La desalación es suficiente para los cebadores y las sondas de captura. Reconstituir oligonucleótidos en agua libre de nucleasa a la concentración deseada y almacenar a -20 ° C hasta por varios meses.

2. Buffer, Biblioteca, y la preparación de muestras

1. Preparar 500 ml de tampón de Millipore o agua de calidad libre de nucleasa con concentraciones de 50 mM Tris, NaCl 137 mM, 5 mM _MgCl2, pH 7,4. Filtrar el tampón a través de una membrana de 0,2 micras estéril; el almacenamiento es posible en condiciones ambientales durante meses.
   1. Alternativamente, utilizar otros tampones tales como PBS (tampón fosfato salino), HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico), etc.
2. La creación de dos termomezcladores; establecer uno a 95 ° C y mantener a la otra en condiciones ambiente (~ 20 ° C en este trabajo). Preparar un cubo de hielo.
3. Calor / SNAP enfriar la biblioteca de ADN mediante la colocación de 100 biblioteca l (~ 2,5 nmol por 10 ¹⁵ -10 ¹⁶ secuencias) en el termomezclador establecer unt 95 ° C durante 5 min. Se coloca el tubo en hielo mientras que las perlas magnéticas se preparan (secciones 3.1 a 3.6). Determinar la concentración real de la biblioteca de ADN por absorción UV a λ = 260 nm y aplicando el factor de conversión apropiado para la biblioteca.
4. Preparar las soluciones de destino de las acciones en un medio apropiado para la solubilidad objetivo.
   1. Preparar 100 acciones de analitos mM en DMSO. Estas poblaciones son viables por aproximadamente 1 mes si se mantienen en condiciones ambientales, pero diferentes objetivos demostrarán diferentes perfiles de degradación.

3. Preparación de perlas magnéticas y ronda inicial de Selección

1. Vortex 6,7 x 10 ⁸ / perlas de perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina ml y eliminar el 400 l a un nuevo tubo de microcentrífuga. Colocar el tubo en el imán durante 2 min y separar el sobrenadante.
2. Lavar las perlas mediante la adición de 400 l de tampón de unión, agitación en vórtex, y aspirar el sobrenadante después de colocarel tubo en el imán para separar las perlas. Repita este proceso tres veces.
3. Inmovilizar la sonda de captura en las perlas magnéticas resuspendiendo las perlas en tampón de unión 400 l con 50 mM sonda de captura (final) e incubando durante 10 min con agitación suave en el termomezclador en condiciones ambientales.
4. Lave las perlas tres veces con 400 l de tampón de unión mediante la repetición de las etapas de lavado que se describen en la sección 3.2 para eliminar la sonda de captura libre.
5. Volver a suspender las perlas en 400 l de tampón de unión. Sacar 100 l de la solución de bolas para los próximos pasos, y retener a los 300 l restantes a 4 ° C para utilizar para nuevas rondas de selección para un máximo de tres semanas.
6. Lave las perlas dos veces con 200 l de tampón de unión como se describe en la sección 3.2.
7. Añadir los 100 l de complemento enfrían el ADN de la sección 2.3 de las perlas lavadas e incubar durante 30 minutos con agitación suave con el termomezclador en condiciones ambientales.
   NOTA: Las concentraciones de ADN en las primeras rondas son más altos que el de las rondas posteriores para reducir al mínimo la pérdida de secuencia en rondas anteriores donde las secuencias únicas son teóricamente presente.
8. Cuantificar el ADN en el sobrenadante usando la absorción de UV como en la sección 2.3 y restar este de la cantidad inicial añadida en la sección 3.7 para evaluar la cantidad de ADN unido a las perlas.
   1. Lavar las perlas con 200 l de tampón seguido de dos lavados adicionales con 200 l de tampón de unión con agitación suave en un termomezclador durante 5 minutos en condiciones ambientales de unión.
9. Resuspender las perlas en 200 l de 100 mM de destino diluidas en tampón de unión, y gire en el termomezclador durante 30 minutos en condiciones ambientales. Preparar las soluciones de trabajo fresco al comienzo de cada día antes de la selección, porque se observaron el objetivo y el control a agregarse fuera de la solución acuosa con el tiempo. Conservar la solución sobrenadante que contiene la secuencia diana eluidas en estudio.
10. Realice la selección negativa después de la finalización de 1-2 rondas mediante la adición de 200 l de 1 mM de progesterona a las perlas preparadas en la sección 3.8.1. Agitar suavemente durante 30 minutos en el termomezclador en condiciones ambientales.
11. Utilice el soporte magnético para capturar las bolas y descartar el sobrenadante, lavar las perlas dos veces en 200 l de tampón antes de la adición de cortisol vinculante como en la sección 3.9.

4. Seguimiento de enriquecimiento, PCR, y de una sola hebra de ADN Generación

1. Añadir la solución de sobrenadante a un casete de diálisis para controlar el enriquecimiento de selección. La diálisis es necesario quitar cortisol a partir del ADN eluido porque cortisol está presente en concentraciones mucho más altas que el ADN, y también tiene un pico de absorción UV que se superpone el estándar _max ADN UV λ = 260 nm.
   1. Realice este paso vtas (rondas 2, 4, 6, y 8) en las primeras rondas de selección. Esto mitiga muestra loss cuando potencialmente unos números de copias de cada secuencia están presentes (diversidad más alta). Para resultados más rápidos, los métodos alternativos tales como columnas de exclusión por tamaño se pueden utilizar también.
2. Dializar casete con la muestra en fresco 250 ml de tampón de unión durante 2 horas en condiciones ambientales dos veces. Reemplace tampón y se incuba a 4 ° CO / N.
3. Analizar la piscina dializada por espectroscopía UV para determinar el porcentaje de ADN eluido por el objetivo (comparar con los resultados de la sección 3.8).
4. Preparar un gel de agarosa al 3% con 1% w / v bromuro de etidio. En este trabajo, preparar un gel a partir de 1,5 g de agarosa, 50 ml de tampón TAE (40 mM Tris Acetato, EDTA 1 mM, pH = 8,0), y 10 l de bromuro de etidio.
5. Ciclo-optimizar la piscina dializada mediante la realización de una pequeña escala de PCR (5 x 50 ml de alícuotas) utilizando ~ 5-15 ciclos. Para los componentes de la PCR, utilice tampón de PCR 1X de reacción (todas las concentraciones finales), 200 mM dNTPs, 10% volumen de reacción de plantilla de ADN, 500 nM de cada cebador, y 2,5U de la polimerasa (2,5 U / l de valores).
   1. Run PCR usando condiciones optimizadas a 95 ° C durante 2 min, seguido por repetidos ciclos de 95 ° C (30 segundos), 55 ° C (30 seg), y 72 ° C (1 min), y luego una 72 ° C (10 min) extensión final y mantener a 4 ° C.
   2. Emplear una escalera estándar de 25 pb para la comparación y visualizar en un reproductor de imágenes de gel. Seleccione el número de ciclos que produce la banda de mayor intensidad en el marcador de tamaño correcto sin productos por-no deseados.
   3. Analizar los resultados de la optimización del ciclo mediante la combinación de 10 l de cada ciclo de PCR con 2 l de 6x azul / naranja colorante de carga, y la carga en 5 pocillos separados del gel de agarosa al 3% preparada en el paso 4.4 (125 V durante 45 min).
6. Realizar un PCR a gran escala utilizando las condiciones y número de ciclo apropiado determinados en el apartado 4.5. Normalmente se requieren de 6-8 ml de reacciones de PCR para obtener el 1-2,5 nmol utilizado para cada ronda en esta selección. Utilice tubos de 8-tira para simplificarel manejo de los muchos tubos necesarios para alícuota este volumen para la amplificación por PCR.
7. Preparar un gel de agarosa al 3% como se describe en la sección 4.4, y validar que la banda de producto de PCR aparece en la posición correcta, siguiendo los pasos de las secciones 4.5.2-4.5.3.
8. Convertir todo el producto de doble cadena de ADN a partir de la sección 4.7 de ADN de cadena sencilla por los pasos que se indican a continuación:
   1. Añadir 300 l de perlas recubiertas con estreptavidina (no magnética) a una pequeña columna bloqueados por las fritas. Lave las perlas con 5 ml de tampón de unión adjuntando una jeringa luer-lock y aplicando una leve presión sobre el émbolo. Retire la jeringa de la columna y retirar el émbolo de la jeringa fuera de línea después de la adición de cada material así que los granos no se vean perturbadas por aspiración émbolo.
   2. Añadir el producto de la PCR y pasarlo a través de la columna usando una suave presión sobre el émbolo. Utilice varias columnas de tal manera que no se añade más de 1 a 1,2 ml de producto de PCR para cada columna. Deseche el fl definitivaow a través desde el ADN será retenido en la columna por el resto de biotina en la cadena anti-sentido.
   3. Lavar la columna con 5 ml de tampón de unión.
   4. Dehybridize el ADN mediante la adición de 0,5 ml de 0,2 M NaOH. Conserve el eluido ya que contiene el ADN de una sola hebra sentido.
9. Desalar el ssDNA en 0,2 M NaOH mediante la adición de los 0,5 ml a una columna de desalación preparado por un lavado con agua libre de nucleasa. Deseche el fluido inicial de 0,5 ml, a continuación, añadir agua libre 1 ml nucleasa y recoger esta muestra desalada ssDNA. Se requerirá que el uso de múltiples columnas de desalación para cada porción de 0,5 ml.
   1. Determinar la concentración de ADN eluido mediante absorción UV a λ = 260 nm.
   2. Vacuum secar la muestra y reconstituir en un volumen apropiado de tampón de unión. Si no había suficiente ADN obtenido para la próxima ronda de selección, repetir secciones 4.6-4.9.2.

5. posteriores rondas de selección y secuenciación

1. Ajuste la rigurosidad de las condiciones de selección en función de los resultados de la vigilancia de enriquecimiento (sección 4.1). En general, hacer que las condiciones más estrictas en las rondas sucesivas de selección con el fin de seleccionar el aglutinante más alta afinidad de la piscina.
   NOTA: Esto podría implicar una combinación de aumento de la concentración de ADN, aumentando el número, el tiempo, o el volumen de las etapas de lavado, disminuyendo la concentración objetivo, el aumento de la concentración del compuesto de selección negativa, o una variedad de otros métodos ^27.
   1. Aplicar controles adecuados según sea apropiado para asegurar la especificidad de las secuencias para la molécula diana. En este trabajo, aplicar una molécula de selección negativa (progesterona) para el sistema (Tabla 1) comenzando en la ronda 3 y el aumento en la concentración a lo largo de la selección. Comenzando en la ronda 11, pre-incubar la piscina de ADN durante 30 minutos con 10-20 mM de progesterona antes de la inmovilización sobre las perlas (antes de la sección 3.7).
   2. Aumentar la longitud de la sonda de captura después de que se observó enriquecimiento máximo.
2. Preparar la piscina final (vuelta 15) y otros grupos que representan al máximo enriquecido (ronda 13) y mínimamente enriquecido (ronda 6) Condiciones para la secuenciación de amplificación por PCR con cebadores compatibles y una polimerasa de alta fidelidad.
   1. Establezca un volumen de 50 l de reacción utilizando concentraciones finales de 1x (tampón de reacción), 200 mm (cada dNTP), 400 nm (cada cebador), 0,5 l de ADN piscina y 0,5 l de polimerasa. Ciclo optimizar para cada ronda con los pasos descritos en la sección 4.5 utilizando las mismas condiciones de PCR con la excepción de una bodega de 7 min a 72 ° C para la extensión final.
   2. Enviar 50 l de las piscinas preparados a una instalación de secuenciación en tubos de microcentrífuga con tapas completamente sellados con una envoltura no adhesiva. Colocar los tubos en un tubo cónico de 15 ml llena de plástico de burbujas y el buque O / N con bolsas de hielo a la instalación de secuenciación.
3. Determinar el número de copias de cada secuencia para evaluar el enriquecimiento de la piscina secuenciado (s).
   1. Utilice el código de escritura / clasificación pasos (Ver Código complementario Archivo) para los datos de secuenciación de próxima generación en formato FASTA para determinar los números de frecuencia / copia de cada secuencia repetida en los datos para todas las piscinas suministrados por la instalación de secuenciación:
4. Analizar la especificidad y afinidad de las secuencias más altos de número de copias. El tipo de interacción (proteína o una molécula pequeña), las propiedades estructurales del aptámero tras la unión, y la afinidad esperada dictará qué método es apropiado. En este tema se revisa con más detalle en una serie de referencias ^1,28-30.

6. AUNP Síntesis y Detección

1. Sintetizar los AuNPs utilizando el método de reducción de citrato ^21. Mezclar 98 ml de agua Millipore con 2 ml de 50 mM HAuCl ₄ y llevar a ebullición.
2. Añadir 10 ml de citrato sódico 38,8 mM comopronto como comienza el reflujo. Color cambiará a un color rojo después de varios minutos. Continuar agitando la solución durante 20 min con el calor.
3. Dejar que la solución AUNP enfriar a ta y después se filtra a través de una membrana de 0,2 micras de poliéster. Guarde todas las suspensiones AUNP en una botella de color ámbar oscuro.
4. Calcular la concentración AUNP por absorción UV, utilizando el coeficiente de extinción de 2,4 x 10 ⁸ L mol ^-1 cm ^{-1 31.} La concentración fue de 10 nM en este trabajo, con un tamaño de 17 ± 0,6 nm determinado por dispersión de luz dinámica ^21.
5. Incubar el ADN con 10 nM AUNP durante 1 hora en condiciones ambientales protegidas por papel de aluminio. Variar el volumen de AUNP para proporcionar suficiente solución para permitir que todas las pruebas deseadas a realizar (~ 1.2 ml). Cargando densidades de 73, (moléculas de ADN por AUNP) 120 y 200 D / NP fueron examinados en este trabajo, y el volumen y concentraciones variarán en consecuencia.
6. Diluir la solución de ADN / AUNP 1: 1 utilizando HEPES tampón (HEPES 20 mM, 2 mM de MgCl _2, pH = 7,4). Dejar que la mezcla se equilibre a temperatura ambiente cubierto con papel de aluminio.
   NOTA: El tiempo requerido para este paso tendrá que ser optimizado por el investigador. En este trabajo, los tiempos que van desde varios minutos a O / N se investigaron.
7. Preparar analito (cortisol, ácido cólico, 2-metoxinaftaleno) soluciones madre de 100 mM en DMSO y cubrir con papel de aluminio. Haga soluciones iniciales frescas antes de cada experimento mediante dilución de las acciones a 100 mM en una dilución 1/3 del tampón de unión de cortisol (sección 2.1). Además diluir la solución inicial con el tampón de unión 1/3 de tal manera que se añade un volumen constante (10 l) de la diana para generar un intervalo de concentraciones.
8. Optimizar la concentración de sal requerida mediante la adición de 80 l de la solución de ADN / AUNP con 10 l de tampón de unión 1/3 (referido como el "blanco").
   1. Incubar durante 20 min a TA, luego agregar diferentes volúmenes de NaCl solutde iones. Mira para el volumen de sal que induce un cambio apenas perceptible visualmente hacia una tonalidad azul después de la adición de sal (13-40 l de 1 M NaCl utilizado en este trabajo). Esto proporciona un buen punto de partida, pero puede ser necesario un nuevo ajuste tras los resultados incluyendo Además objetivo.
9. Combinar 80 l de la solución de ADN / AUNP con 10 l de la solución objetivo y se incuba durante 20 min a TA. Utilizar una placa de 96 pocillos y pipeta multicanal para analizar múltiples concentraciones diana simultáneamente, incluyendo siempre un blanco (sección 6.8).
   1. Añadir el volumen apropiado de solución de NaCl (13 l de 1 M NaCl se aplicó en este trabajo) y analizar inmediatamente la absorbancia a 650 y 530 nm usando un lector de placas.
10. Representar gráficamente los resultados como la relación de los valores de absorbancia (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ frente a la concentración objetivo normalizado con respecto a la medición en blanco.

Resultados

La severidad de las condiciones se mantuvo inicialmente baja para retener aglutinantes presentes en bajo número de copias en las primeras rondas. La primera ronda, en particular, implementó la rigurosidad más baja para preservar aglutinantes normalmente presentados como secuencias únicas, demostrado por la alta concentración de ADN y cortisol, y la falta de pasos de selección negativos. El éxito de esta selección aptámero se demuestra por la evolución de las piscinas de un porcentaje bajo eluida por el objetivo (ronda 2) para una mayor fracción eluida por el objetivo que permanece relativamente constante en las rondas 12-13 (Tabla 1). Esta meseta de ADN eluido por el blanco es tradicionalmente un punto final en la selección ("enriquecimiento"). Sin embargo, este método elevó adicionalmente la rigurosidad de la selección después del enriquecimiento mediante el aumento de la longitud de la sonda de captura de ADNc (Figura 1). El alargamiento de esta sonda aumenta la fuerza de la hibridación entre el CDNA y la piscina, el aumento de la temperatura de fusión (T _m) del complejo, y que requieren una interacción más fuerte entre el objetivo y la secuencia para liberar las secuencias de unión a la solución. La primera ronda de selección implementa una interacción cDNA más débil debido a uno menos la base G en el extremo 5 'de la biblioteca. Esto está en consonancia con las condiciones de rigurosidad en general más bajas en la primera ronda, y no se espera un impacto significativo en la selección que no sea al permitir aglutinantes más potenciales, así como secuencias de antecedentes (dehybridize basados ​​en la termodinámica) para pasar a la siguiente ronda de selección. Estas secuencias de antecedentes se minimizaron como la selección continuó hacia el enriquecimiento mediante la implementación de mayores condiciones de rigurosidad en las selecciones posteriores. Cuando el cDNA se alargó de una 7-mer a un 8-mer en la ronda 14, el porcentaje de ADN eluido por el objetivo se redujo de 15,3% a 11,1% para un T _m se incrementó de 19,2 ° C a 26,7 ° C. El ADNc wprorrogado hasta el 9-mer en la ronda 15 con una _Tm de 31,3 ° C, cayendo del total eluida a 3,3%.

Más información sobre el enriquecimiento puede obtenerse mediante la secuenciación de varias piscinas, ambos ejemplos enriquecidos y no enriquecidos, con el fin de realizar un seguimiento de la progresión de las piscinas en cada ronda. Secuenciación de próxima generación (NGS) se ha convertido en un poderoso método para la secuenciación en la selección, sobre todo porque mayor secuencia lee (número total de secuencias informó) se obtienen en comparación con la secuenciación de Sanger. Estos mayores secuencia lee presentan una mayor cobertura del número total de secuencias en la piscina, que proporciona una imagen más completa de la diversidad de secuencias. NGS también elimina el sesgo de clonación ^32, y permite la secuenciación de varios grupos en un solo lote con la adición de códigos de barras ^24,33. NGS se utilizó para analizar la progresión de enriquecimiento a partir de tres piscinas separadas en esta selección de la muestra (Figura 2). Piscinasa partir de la ronda 6 (leve enriquecimiento en comparación con la ronda 2% por eluyó), redondo 13 (enriquecimiento más alto), y alrededor de 15 (astringencia alta) fueron elegidos como puntos representativos de la selección. El número de copias de cada secuencia única se representaron gráficamente como un porcentaje del número total de secuencia lee para cada piscina. El mejor clasificado (el más alto número de copias) secuencia sólo constituye el 0,1% de todas las secuencias en la ronda 6 (33435 secuencias totales, 22.463 secuencias únicas). A medida que la piscina se enriquece al máximo en la ronda 13, los mejor clasificados secuencia aumenta a comprenden el 15,4% de toda la piscina (17.681 secuencias totales, 2987 secuencias únicas), 150x más alta que en la ronda 6 a pesar de sólo un ~ 5x aumento de enriquecimiento observado por UV . Ronda 15 (28.919 secuencia Total de Lecturas, 2980 secuencias únicas) aumentaron a 44,9% de todas las secuencias representadas por la secuencia de mejor clasificado única aun cuando el seguimiento de enriquecimiento de UV mostró que la cantidad eluida por el objetivo era ~ 5x menor que la de la ronda 13 ( Tabla 1 ). Enriquecimiento también se demuestra por el menor porcentaje de secuencias únicas (67% en la ronda 6 a 10% en la ronda 15) como la piscina evoluciona de muchos a varias secuencias de unión a la diana con potencial. Adicionalmente, la secuencia mejor clasificado en la ronda 13 (15-3) fue la tercera secuencia de número de copia alto en la ronda 15 después de la longitud de ADNc se extendió, y la secuencia segundo clasificado en la ronda 13 se convirtió en la secuencia más alto número de copias en la ronda 15 (15 -1):

15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

Estudios previos examinaron la unión de estas dos secuencias por termoforesis microescala y diálisis de equilibrio ^24. Los resultados mostraron cortisol significativa de unión para la secuencia de 15-1 (K _d = 6,9 ± 2,8 mM por diálisis de equilibrio; 16,177; 0,6 mM de termoforesis microescala), mientras que el mínimo se observó unión entre el cortisol y la secuencia de 15-3. Esto demuestra que el aumento de la longitud de la sonda de captura en la ronda 15 ayuda en la provisión de condiciones de astringencia altas para analizar el ligante de mayor afinidad. Además, ni la secuencia demostró observable unión a la molécula de selección negativa, la progesterona, que muestra que la adición de los pasos de selección negativa era beneficioso para el procedimiento.

El hecho de que un aglutinante mayor afinidad surgió después del enriquecimiento máximo (determinado por el método tradicional de analizar el porcentaje de ADN eluido por el destino) después de que se aplican condiciones de astringencia elevadas en posteriores rondas de selección valida el método de extender la longitud de la captura de cDNA sondear post-enriquecimiento. Este resultado muestra que el número de copias de una pila de secuenciado y afinidad por la diana sólo pueden estar asociados bajo ciertas condiciones ^24,34, en Concontraste con un informe previo que implica una correlación directa ^35. También destaca el beneficio de enriquecimiento de vigilancia por NGS, y no solamente por la estrategia% eluido común en la mayoría de las selecciones, que puede variar de forma natural de una fase a la siguiente como se aplican las condiciones de astringencia altas. Sin embargo,% eluido es útil para el enriquecimiento de monitoreo cuando se aplican condiciones similares a través de varias rondas. Por ejemplo, las rondas 6-10 condiciones similares a todos los involucrados, sin cambios significativos en el enriquecimiento (Tabla 1). Cuando esto se observa en varias rondas, las condiciones probablemente son demasiado estrictas para promover el enriquecimiento, y el investigador deben disminuir la rigurosidad en la siguiente ronda. Por ejemplo, la concentración de cortisol se aumentó de 35 mM a 100 mM en las rondas 11-13, y el% eluye aumentó de 2,5% en la ronda 10 a 14,5% en la ronda 12. Por lo tanto,% eluido puede servir como una guía para ajustar la rigurosidad durante el curso de una selección cuando similar condiciones se comparan de ronda a ronda, y pueden proporcionar información complementaria a NGS para determinar un punto final de la selección.

Secuencia 15-1 se aplicó a un ensayo AUNP para determinar si una secuencia seleccionada de una manera para producir un aptámero estructura de conmutación funcionaría en un ensayo que se basa en un cambio estructural después de la unión para producir una respuesta objetivo. Estudios iniciales anteriores mostraron que el ensayo AUNP con 15-1 respondió a la biomarcador cortisol estrés, pero otros no dos marcadores de estrés, la epinefrina y la norepinefrina, o ácido cólico, un marcador de la enfermedad hepática estructuralmente similar al cortisol ^24. Se observó la respuesta en el rango normal de cortisol libre indicado en el suero humano (~ 150-600 nM) ^6, la validación de que el aptámero seleccionado para un cambio estructural en la unión de cortisol produce una respuesta en el ensayo de AUNP. En este trabajo actual, la caracterización del sistema fue llevado un paso más allá mediante el ajustela cobertura (densidad) de 15-1 en la superficie AUNP. Utilizando el mismo conjunto de condiciones, la cobertura de ADN se incrementó de 73 D / NP (moléculas de ADN / AUNP), a 120 D / NP y 200 D / NP (Figura 3). Ácido cólico produce una respuesta mínima, con la excepción de 10 micras, con 200 D / NP. Se aumentó la respuesta del ensayo disminuyó a medida que la cobertura que hicieron los límites de detección (LOD). El límite de detección fue de 29,5 nM para 73 D / NP, 145,2 nM para 120 D / NP, y 27,3 M durante 200 D / NP. Este resultado está de acuerdo con el trabajo de Smith et al., Que ilustra que la respuesta de un ensayo AUNP utilizando el aptámero cocaína disminuyó cuando la cobertura de aptámeros se incrementó de 60 D / NP 300 D / NP ^36. Esto implica que el rango de detección para el objetivo de interés puede ser ajustada basada en la optimización de la cobertura de la superficie de ADN en el ensayo AUNP. Esto podría ser beneficioso cuando se comparan, por ejemplo, la gama de cortisol libre en el suero humano (~ 150-600 nM) frente a la saliva humana (~ 5-25 nM) ^{6,37. Mientras que los fluidos fisiológicos son mucho más complejas que este tampón de ensayo, los resultados proporcionan una extensión del trabajo de prueba de principio que demuestra que las condiciones AUNP pueden ajustarse dependiendo de la aplicación, y que la labor futura de la ampliación a medio y fluidos biológicos sería de interés para la comunidad biosensor.}

Figura 1. Visión general del método de selección de estructura de conmutación. Una pequeña sonda de captura cDNA biotinilado se inmoviliza sobre perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. El ADNc es complementaria a la región 5 'de la biblioteca, la hibridación de la biblioteca a las perlas. Cuando se añade objetivo, se induce un cambio conformacional para liberar secuencias de unión de la perla, permitiendo partición facilitada por la aplicación de un imán. El sobrenadante se retiene para controlar el enriquecimiento (% del ADN se eluyó por Thcorreo de destino) por UV después de dializar la meta a partir del ADN. Este paso sólo es necesario si la molécula diana absorbe en el mismo rango UV como ADN. Las secuencias se amplificaron por PCR a continuación y preparados para la siguiente ronda de selección. Como la selección progresa, se aplica la selección negativa, donde se descartan secuencias eluidas por la molécula de selección negativa, y las perlas con potenciales aglutinantes diana se incuban a continuación con objetivo. La longitud de la sonda de ADNc se incrementa después del enriquecimiento máxima (% eluido) para aumentar la rigurosidad de la selección. Esta cifra ha sido reimpreso con el permiso de ^24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ronda	[Cortisol] (M)	[Progesterona] (M)	ADN Bound (pmol)	% Eluido por Target	ADNc de longitud
1	100	0	357.57	N / A	7-mer
2	50	0	145.49	1.4	7-mer
3	50	1	188.74	N / A	7-mer
4	50	5	336.4	2.3	7-mer
5	35	5	88.05	N / A	7-mer
6	35	10	303.89	3.1	7-mer
7	35	10	255.01	N / A	7-mer
8	35	10	236.81	2.1	7-mer
9	35	10	318.95	2.6	7-mer
10	35	10	297.18	2.5	7-mer
11	100	10	147.61	N / A	7-mer
12	100	10	154.36	14.5	7-mer
13	100	10	150.39	15.3	7-mer
14	75	20	247.71	11.1	8-mer
15	50	40	409.63	3.3	9-mer

Tabla 1. progresión de selección y enriquecimiento por elución% ²⁴ < strong>. N / A (no aplicable) se informa para las rondas de vigilancia, donde el enriquecimiento de diálisis / UV no se realizó en las rondas de selección temprana para mitigar la pérdida de secuencias de bajo número de copias. Esta tabla ha sido reimpreso con el permiso de ^24.

Figura 2. Selección de enriquecimiento determinado por secuenciación de próxima generación (A) Ronda. 6; (B) Ronda 13; (C) de la Ronda 15. Las secuencias fueron clasificados de acuerdo con el número de copias. La secuencia más alto número de copias incrementado de constituir un bajo porcentaje de toda la piscina secuenciado en la ronda 6 (0,1%) a un alto porcentaje en la ronda 15 (44,9%) como la piscina fue enriquecida para secuencias de unión de cortisol. Esta cifra ha sido reimpreso con el permiso de ^24.et = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. AUNP respuesta del ensayo de variación de aptámero 15-1 cobertura. La densidad del aptámero se incubaron con el AuNPs se aumentó de 73 D / NP (triángulo rojo), a 120 D / NP (cuadrado verde) y 200 D / NP ( círculo azul). Respuestas de cortisol son colores llamativos, la respuesta de ácido cólico es en colores claros. La respuesta de ensayo se mejora para cortisol a densidades más bajas, reduciendo así la LOD y el rango de la meta puede ser detectado dentro. Las condiciones con la más alta respuesta de cortisol (73 D / NP) se caracterizaron adicionalmente en el rango lineal para proporcionar más puntos dentro del rango normal esperado de cortisol libre indicado en el suero humano (~ 150-500 nM) y saliva (5-25 nM ) ^6,37. La respuesta mínima de ácido cólico aplicando las mismas condiciones 73 D / NP tiene seren detalla en el trabajo previo ^24. Todas las parcelas representan la media ± SEM para medidas duplicadas o triplicadas.

. Figura 4. Los resultados representativos de optimización del ciclo de PCR De izquierda a derecha los pozos representan: 4 ciclos, 6 ciclos, 8 ciclos, 10 ciclos, 12 ciclos, negativo (sin molde de ADN), 25 pb estándar escalera del ADN. Las condiciones óptimas se observan en 8 ciclos, donde la banda solo producto es de alta intensidad sin exceso de amplificación de los productos presentes en los ciclos superiores.

Figura 5. AUNP optimización del tiempo de incubación del ensayo. El tiempo de incubación de la etapa de AUNP / ADN en 73 D / NP se redujo de O / N (Figura 3) a 30 min, y la incu objetivobación fue seguido inmediatamente por la adición de sal en lugar de después de 20 min (Figura 3). Se observa (A) Una respuesta de cortisol (diamantes azules), pero no para el ácido cólico (círculos verdes) o 2MNP (2-metoxinaftaleno; cuadrados rojos). Todas las parcelas representan la media ± SEM para medidas duplicadas o triplicadas. (B) De izquierda a derecha: en blanco, 10 cortisol M, 10 mM ácido cólico, 10 mM 2MNP. Cambio visual se puede observar a simple vista para el cortisol. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El hecho de que las moléculas pequeñas son de interés biológico, pero sólo representan el 19% de todos los aptámeros reportados hace métodos diseñados para la selección de aptámeros que son aplicables a las pequeñas moléculas de gran importancia. SELEX de pequeñas moléculas es particularmente desafiante ya que menos grupos funcionales, motivos estructurales, y área de superficie están disponibles para la interacción con secuencias de proteínas en comparación con ^1, y se ha estimado que menos del 30% de selecciones para todos los objetivos intentos han resultado en un aptámero ^38. Por lo tanto, uno debe ser excepcionalmente consciente de diseño experimental y ejecución con el fin de seleccionar con éxito un aptámero para una diana de molécula pequeña.

El método de selección aptámero descrito en este trabajo es ventajoso debido a que es aplicable a moléculas pequeñas sin necesidad de ninguna modificación química que puede alterar sus propiedades de unión. También es elución con base, lo que significa que desde tADN que, en lugar de la diana, se une inicialmente después se eluyó de las perlas magnéticas por el objetivo, el ADN interactuar con la matriz del grano no será amplificado para la siguiente ronda de selección porque aglutinantes a la molécula de interés se liberan en el tampón sobrenadante y aglutinantes de la matriz no específicos siguen siendo enlazado. Por el contrario, se requiere un método de selección negativa contra la matriz para los métodos que inmovilizan el objetivo al soporte sólido cada ronda porque el ADN que interactúa con la matriz se amplifica además de los aglutinantes objetivo ^1. El método actual fue diseñado como una estrategia de selección limitada T _m. Esto significa que el T _m del ADNc / piscina hibridación se mantuvo cerca de RT. Morse utilizó una estrategia similar, pero aplica una sonda de ADNc de 6-mer con una T _m <10 ° C con condiciones de selección a 4 ° C ^17. Nuestra aplicación era para un ensayo de biosensor realizado a temperatura ambiente, por lo que la longitud del ADNc se ajustó de acuerdoly. Esto mantiene la rigurosidad de la selección suficientemente baja para que ligantes potenciales no se pierden debido a la interacción de unión diana se produce en una ubicación remota que no induce un cambio conformacional capaz de interrumpir cDNA de unión. Sin embargo, la eficiencia de partición del método propuesto es baja debido a que algunas secuencias se dehybridize únicamente sobre la base de la termodinámica. En contraste, Nuţiu et al. Aplica un ADNc 15-mer, y sólo fueron capaces de identificar aptámeros para dos de los cuatro objetivos, posiblemente debido a la T _m de la 15-mer era demasiado alta para permitir una liberación por un blanco de molécula pequeña ^18. Por lo tanto, mientras que la estrategia de selección actual requerirá muchas rondas para eliminar las secuencias de fondo, mediante el control de la rigurosidad de la selección y reducir al mínimo la pérdida de ligantes potenciales se verá incrementada la probabilidad de éxito.

Muchos investigadores nuevos en la selección de aptámeros son conscientes de los aspectos importantes relacionados con la PCR deligantes potenciales. Optimización del ciclo (sección 4.5) es necesario porque el exceso de amplificación de bibliotecas de ADN produce subproductos no deseados (típicamente más grandes en tamaño) en los números de ciclo elevadas, y el producto deseado puede desaparecer por completo con un exceso de sólo 5 ciclos de ^39. En el caso de exceso de amplificación, los productos de PCR ya no representan aquellas secuencias eluidas por el blanco, y las posibilidades de éxito de la selección se disminuyen significativamente. La Figura 4 ilustra un ejemplo de optimización del ciclo de la ronda 5 en este trabajo. El ciclo más bajo produce una banda de producto mínimo, los aumentos en la cantidad de la banda a través de 8 ciclos; en 10 ciclos de la banda comienza una transición a un tamaño mayor exceso de amplificación del producto, y está compuesta casi en su totalidad del producto sobre-amplificado dentro de 12 ciclos. Otro detalle que muchos investigadores sin experiencia en SELEX puede pasar por alto es (sección 4.6) en el abeto que toda la piscina debe ser amplificado en la amplificación por PCR a gran escalast ronda para mitigar la pérdida de los aglutinantes. El número de secuencias únicas posibles a partir de oligonucleótidos es 4 ^N, donde 4 representa las cuatro bases de ácidos nucleicos, y N es el número de bases en la región al azar de la biblioteca. Para este trabajo, N = 40, lo que resulta en un espacio de secuencias de 1.2 x 10 ²⁴ posibles secuencias únicas. El 2,5 nmol de la biblioteca usada en la primera ronda de selección corresponde a ~ 10 ¹⁵ moléculas, lo que significa que cada copia de ADN está probablemente representado en la piscina inicial como una secuencia única. Por lo tanto, todo el volumen de ADN eluido de las cuentas por el destino debe ser amplificada para conservar una copia de cada ligante potencial para la siguiente ronda de selección. Una vez que se ha producido esta amplificación inicial, varias copias están disponibles para su selección en las siguientes rondas donde se asume una solución homogénea para el muestreo.

La concentración de objetivo también debe ser considerado cuidadosamente en cada ronda. Nuţiu et al. Usoconcentración da de objetivo 1 mM durante todo el proceso de selección, y seleccionó un aptámero ATP con K _d = 600 mM ^18. Tanto el trabajo actual y la investigación de Morse ¹⁷ comenzaron con 100 mM de destino, disminuyendo a lo largo del curso de la selección, y resultaron en aptámeros con afinidades bajas micromolares. Exactamente lo que ronda el rigor debe aumentarse (concentración objetivo inferior) depende de cuando se observa enriquecimiento. Otro paso crítico es aplicar los pasos de selección negativos apropiados de modo aptámeros demostrar la especificidad de la molécula diana. Que se utilizan controles es contingente a la aplicación prevista del aptámero seleccionado. Por ejemplo, aptámero 15-1 fue diseñado para funcionar como un elemento de reconocimiento en un ensayo de biosensor para cortisol, por lo que la progesterona se usó como una molécula de selección negativa, ya que es un precursor metabólico para cortisol que se encuentra en los fluidos fisiológicos ^40. El aptámero ATP seleccionada por Nuţiu et al. </ Em> no incluyó una etapa de selección negativa, e interactúa con las moléculas estructuralmente similares incluyendo ADP, AMP, la adenosina, y dATP ^18.

Una nota final a considerar es que el ensayo AUNP menudo requiere la optimización considerable para cada par de aptámeros / target. Buscando el volumen de sal que induce un cambio apenas perceptible visualmente hacia una tonalidad azul después de la adición de sal es un buen punto de partida, pero el ajuste del punto de partida podría ser obligado a observar una respuesta. También hemos encontrado que el ensayo produce drásticamente diferentes respuestas dependiendo de la concentración de tampón (el tampón de selección puede requerir dilución debido a que la alta concentración de sal de tampones a menudo causa la agregación) y la composición, el grado de cobertura de ADN (Figura 3), preparación de la muestra (algunos orgánica disolventes utilizados para disolver el objetivo pueden causar un alto fondo que se dirigen a las máscaras de respuesta), la temperatura, el tipo de sal y concentración, y INCUBAtiempo ción (tanto de ADN con AUNP y ADN / AUNP con objetivo). En condiciones optimizadas por completo, los resultados se observan típicamente con un tiempo de incubación de destino <5 min, lo que demuestra el beneficio de una rápida respuesta del objetivo de la plataforma de biosensores AUNP. Por ejemplo, en la Figura 5 el tiempo de incubación del aptámero / AUNP paso se redujo de O / N (Figura 3) a 30 min, y la sal se añadió inmediatamente (<10 segundos) después de la adición de destino en lugar de 20 min más tarde (Figura 3 ) a una densidad de carga de 73 D / NP. Esto aumentó la respuesta de cortisol a ~ 82% más alto que el espacio en blanco (Figura 5A) a una concentración de 10 mM diana frente al ~ 40% usando las condiciones anteriores (Figura 3). Esta respuesta puede ser distinguido con el ojo desnudo (Figura 5B). Tenga en cuenta que el intervalo lineal de detección de cortisol es diferente que el uso de las condiciones anteriores, lo que sugiere que estas condiciones se pueden optimizar para un deseadorango de detección. Ácido cólico y 2-metoxinaftaleno (2MNP) controles no produjeron una respuesta significativa (Figuras 5A-B). Los investigadores deben ser conscientes de que la reducción de estos tiempos de incubación puede facilitar una mayor respuesta de analitos con la superficie AUNP, que pueden contribuir a la señal global mejorada (objetivo) o de fondo (moléculas no objetivo). Por lo tanto, cuidado AUNP diseño del ensayo y el rendimiento caracterización es necesaria para cada par de aptámeros / target.

Este procedimiento se describe un protocolo para seleccionar pequeños aptámeros estructura de conmutación de moléculas que funcionan en una plataforma biosensor tales como el ensayo descrito AUNP, que requieren un cambio conformacional del ADN para detectar la presencia de la diana. Sin embargo, este método podría aplicarse a otros sistemas tales como biosensores electroquímicos o fluorescencia que funcionan en la misma premisa para prácticamente cualquier tamaño de destino. El poder del protocolo puede desarrollarse más experimentalmente porvarios enfoques. En primer lugar, la selección en sí misma puede ser potencialmente mejorada por métodos de optimización, tales como la determinación de la T _m ideales de la hibridación / biblioteca de ADNc que proporciona una interacción que es lo suficientemente débil para interactuar con una diana de molécula pequeña, pero lo suficientemente fuerte como para reducir la cantidad investigar de fondo secuencias dehybridized únicamente a partir de la termodinámica. Esto se condensará el número de ciclos necesarios para la selección, ahorrando tiempo en el trabajo y reducir el consumo de reactivo. Otras investigaciones sobre modificaciones a la selección sería determinar las concentraciones más favorables de granos y de ADN para que una población diversa de secuencias se expone a la diana, especialmente en la ronda inicial. El éxito de estos experimentos de prueba de principio a proporcionar una base para invertir más recursos hacia la optimización y adaptación del tampón de ensayo AUNP a los fluidos fisiológicos. Hay una necesidad legítima de una plataforma de biosensores robustos rápido que puedas funcio como herramienta de diagnóstico del estado fisiológico de una persona, y el posterior desarrollo del ensayo AUNP en suero humano, el sudor o saliva se reuniría una esta brecha actual.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Dynabeads M280 Streptavidin	Invitrogen	112.06D	Compatible with DynaMag-2 Magnet
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12321D	Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin
Streptavidin Sepharose High Performance	GE Healthcare	17-5113-01	This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation
Hydrocortisone	Sigma	H4001	≥98%
Progesterone	Sigma	P0130	≥99%
Cholic Acid	Sigma	C1129	≥98%
NanoDrop ND-1000	NanoDrop	ND-1000	Replaced by ND-2000 model
Tris Base	Promega	H5135	≥99.9%
Sodium Chloride	Sigma	S9888	≥99.5%
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fluka	63068	≥98%
500 mL Filter System	Corning	430769	0.22 µm cellulose acetate membrane
DNA Library	Operon	Custom	HPLC purified
All other DNA	IDT	Custom	Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC
Thermomixer	Eppendorf	R	Any model with  temperature and mixing speed control will work
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn	Agilent	600674	Taq polymerase can be used as well
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade	Agilent	200415	Other brands will work here
10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer	Agilent	200532	This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase
GeneAmp PCR System	Applied Biosystems	9700	Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work
Agarose-LE	Ambion	AM9040	≥99.9%
Ethidium Bromide	Sigma	E-1510	Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen
Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style	Glen Research	20-0021-01	This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe
Replacement Filters Expedite	Glen Research	20-0021-0F	1 µm size
Illustra NAP-25 Columns	GE Healthcare	17-0852-01	Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette	ThermoFisher Scientific	66205	2k MWCO used
Gold(III) chloride hydrate	Sigma	254169	99.999% purity is important
Sodium Citrate Dihydrate	SAFC	W302600	We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays
SpectraMax	Molecular Devices	M5	Results were similar to Bio-TEK system
Synergy	Bio-TEK	HT	Results were similar to Molecular Devices system
HEPES Buffer	Amresco	J848	Any brand that makes a sterilized product will work
250 mL Filter System	Corning	430767	0.22 µm cellulose acetate membrane
UV Spectrophophotometer	Varian	Cary 300	Other brands will work here
5 mL Syringe	Becton-Dickinson	309646	This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column
ThermoEC Minicell Primo	ThermoFisher Scientific	EC320	Compatible with Power Supply
Power Supply	Fisher Scientific	FB300	Compatible with ThermoEC Minicell Primo
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418	Flammable liquid
2 Methoxynaphthalene	Sigma	148245	99%
Assay Plate	Corning	3370	96-well Flat Bottom, Sterile