共焦点光学イメージングによるローズベンガル光血栓<em&gt;インビボ</em&gt;：単一の容器ストロークのモデル

要約

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

要約

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.

The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

概要

技術はすぐにそのままマウスでローズベンガル光血栓の誘導後のインビボ細胞応答の許可の可視化について説明しました。ローズベンガル（4,5,6,7-テトラクロロ-2 '、4'、5 '、7'-テトラヨード）は、動物モデルにおける虚血性脳卒中（マウス及びラット）を誘導するために使用される感光性染料です。 564 nmのレーザー光を薄く頭蓋骨を介して尾静脈を介して後続の照明RBのボーラス注射に続いて、血栓が生理的発作^を引き起こし¹に誘導されます。この方法は、もともと1977年にローゼンブラム、エル·Sabbanによって記述し、それ以降の1980年代半ば^1,2にワトソンによって適応されました。要するに、ローズベンガルは、その後、組織因子、凝固カスケードの開始剤を活性化し、活性酸素種の生産を生成緑色励起光（この場合は561 nmレーザー）を照射します。凝固カスケードの誘導は虚血性レを生成します臨床ストローク³に病理学的に関連するイオン。

脳卒中は、ニューロン、グリア、内皮および免疫系を含む多くの異なる細胞タイプの相互作用に起因する複雑な病態生理を持っています。特定の細胞プロセスを研究するための最良の方法を選択すると、複数の配慮が必要です。実験技術は、3つのカテゴリのいずれかに広く分類さ： インビトロ 、 インビボ及びそれぞれが長所と短所とインシリコin vitro試験は、それらの天然の環境から細胞を除去する主な欠点を持っているので、そのままで見られる効果を再現できない場合があり、動物を生きた。in vivoでの技術増加翻訳意義と病態の強化実験的複製を提供する。 インシリコ一般的疾患または細胞プロセスのコンピュータモデリングを参照して、ますます試験の潜在的な薬物相互作用を研究するために利用しながら、PLE、収集されたすべての情報は、まだ生きている細胞や組織で試験されなければなりません。

実験室の設定における脳卒中の理想的なモデルは、ヒト集団において見られるものと同様の病理学的特徴を実証する必要があります。ヒト集団において脳卒中の一般的な生理学的特性がありますが、経験した損傷の種類に応じて多くの違いもあります。ヒト集団においてストロークを変化させ、梗塞ボリュームだけでなく、それぞれの病状に関連するメカニズムの違いをもたらすような小さなまたは大血管閉塞、出血性病変、および動脈または心臓塞栓動脈に発生します。動物の脳卒中モデルを利用する利点は、人間のストロークの特性を模倣再現性梗塞の発生です。中大脳動脈閉塞（塞栓または血管内フィラメント法）をモデル遠位MCAOおよび光血栓モデル：もっとも一般的な動物ストロークモデルが使用して動脈閉塞が含まれます。利点各モデルのd欠点は（ ^{図4、図5を}参照してください）他の場所で検討されています。グローバル虚血モデル（MCAO）、実行するのが比較的容易に焦点脳卒中モデルであるよりも、人間のストロークにはあまり関連していました。さらに、これらの方法は、再現性の脳梗塞病変を誘導するのに非常に可変です。実験者は、MCAOモデル上で明確な利点を提供し、よく彼らの実験を制御するように光血栓モデルがあれば高い再現性です。しかし、微小血管傷害のモデルは、最小限虚血性ペナンブラ、細胞を救出^6,7であると考えられる領域を表示することが記載されています。また、血管原性浮腫及び細胞毒性浮腫形成はまた、撮像領域の照射後の誘導され得ます。これらの制限にもかかわらず、技術は、脳卒中^{8、9、10、11}以下の多くの生理学的プロセスに新たな洞察を提供しました。

プロトコル

注：すべての動物の手順は、テキサス大学健康科学センターのサンアントニオの施設内動物管理使用委員会によって承認され、ARRIVEガイドラインと一致しました。

1.皮質の準備のために麻酔

1. 麻酔を誘導するために、酸素と混合して2〜3％のイソフルランで誘導チャンバ内にマウスを置きます。マウスが誘導されると呼吸速度の低下を観察します。マウスはノーズコーンに移動する準備ができているかどうかを決定するために、マウスの足をつまみます。注：麻酔レベルは、任意のin vivoでの調製における重要なステップであるとケアがグローバル虚血の原因となるレベルを誘発しないように注意してください。
2. マウスが十分に麻酔されると、手術/イメージングプラットフォームに動物を転送し、ノーズコーンにマウスの鼻を配置し、麻酔状態を維持するために、1から1.2パーセントのイソフルランを適用します。マウスは、温度共に横たわっていることを確認してくださいntrolled加熱パッドは、残りの手順を通して、体温（37℃+/- 0.5℃）を維持します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目の上の獣医軟膏を置きます。
3. システムに付属の尾や足のクリップを使用して、パルス酸素濃度計システムを使用して、マウスの生理機能を監視します。呼吸数が50〜65呼吸/分の間で維持されることを確認してください。 300から450 BPMと酸素飽和度は、動物の長期生存を確保するために、97から98までパーセントの間で維持される間に心拍数が残っていることを確認してください。
4. マウスが十分に麻酔されると、電気バリカンを用いて頭蓋の上に髪を剃るエタノール綿棒に続く残留髪とベタジンできれいにし、削除します。無菌手術用環境を確保するために3回にこの手順を繰り返します。

2.手術手順

1. 頭皮が完全に洗浄され、坊主で、頭蓋fissuを明らかにするために、マウスの頭皮に、5mmの切開を作りますブレグマを検索する解像度と。
2. 頭蓋の上にある残りの筋膜を除去するために滅菌綿棒を使用してください。
3. ブレグマの定位座標を用いて、頭頂葉皮質の上にある骨に組織接着剤を使用したカスタムステンレス製リング（ 図1）接着剤：横-1〜-3ミリ、2-4ミリメートル。注：接着剤は、典型的には、骨の上にリングを配置した後、2分以内に設定します。
4. マウスを安定させ、画像形成中の移動を防止するために、定位ホルダー（ 図2）環を貼付。
5. 外科用グレードの解剖顕微鏡下で、ゆっくりとそれが開けられるように領域レベルを維持することを確認すること速度制御DREMELのようなツール（Meisinger 3.9ミリメートルドリルビット）を使用して、頭蓋中で1〜2ミリのセクションをドリル。ジグザグパターンを使用してこれを達成します。熱を避けるために構築、低へのドリル速度を設定し、頻繁に休憩を取ります。
6. 頭蓋頭蓋骨は、外観に登るとなると、間伐を続けます頭蓋頭蓋骨の薄層の円滑な除去を容易にするために薄くなった面レベルを維持するために、同じジグザグパターンを利用して手術用メスの刃を使用して頭蓋。メスの刃の先端を使用すると、一度に骨の薄い層を除去するための光の圧力で小さなリニアストロークを行います。血管系は、解剖顕微鏡を通してはっきりと表示されるまでこれを続けます。
7. 実験者の穿刺を介して、または間引き処理中に頭蓋骨を破壊した場合、基礎となる皮質への可能性損傷に動物を安楽死させます。
   注：マウスの​​頭蓋骨は、約300ミクロンの厚さであり、2つの薄い緻密骨の層（1外部と一つの内部層）とコンパクトな骨の2つの層の間に挟まれた海綿骨の層で構成されています。外部コンパクト骨の層および海綿骨の大部分が残っているコンパクトな骨のおおよそ50μmの層が得られ、5mmの掘削領域内に削除されます（ 図2B参照します ）。 Visualiz血管系のationが最終そのまま薄く頭蓋骨が約50μmの厚さであることを保証します。この厚さまで薄くする際の頭蓋骨はまだそのために存在します。

3.顕微鏡セットアップ

1. 客観的なインバータを有している倒立顕微鏡システム（従来、共焦点または二光子システム）を使用します。注：これは、標準的な正立顕微鏡を利用することも可能です。制限要因は、ステージと目標との間の空間になります。ステージへの変更は、このセットアップを実行する必要があるかもしれません。
2. 脇顕微鏡のベースに位置してカスタムメイドのステージに外科的/撮影台を固定します。注：プラットフォームは、対物下外科手術/撮影台の垂直運動を可能にするために、実験室ジャッキを使用して行われます。実験用ジャッキは、4つの円筒状のポールに固定されたプレートに取り付けられています。 （ 図2を参照してください）。
3. 20Xを含む客観的なインバータを置き頭蓋窓の上の目的。顕微鏡の接眼レンズを通して見ることにより、頭蓋窓を見つけ、撮影領域に目標を配置するために外部光源を使用してください。注：撮像領域は、脈管構造の存在によって示されます。
4. 水ベースの目的のために、人工脳脊髄液（aCSFの）を使用します（; 30のKCl、130mMの塩化ナトリウムを12mMのKH ₂ PO _4、200mMの_炭酸水素ナトリウム、30mMのHEPES、100 mMグルコース）培地として、潜在的に撮影時の頭蓋腔への漏出（ 図3）。

4.ローズベンガル染料準備、管理および脳卒中の誘導

1. 人工脳脊髄液（aCSFの）中のローズベンガルの新鮮な20 mg / mlの溶液を調製します。フィルタリングし、投与前に滅菌します。それが混合された後にローズベンガルを再利用したり、保管しないでください。各実験のために新鮮なソリューションを行います。
2. ローズベンガルの一方で、0.1mlの尾静脈注射を与えます溶液の適切な注入を保証するために、561 nmのレーザーで頭蓋窓を缶詰。注：ローズベンガルは、脳の血管系内注射後5秒以内に可視化されます。容器全体は、ローズベンガルで満たされるべきです。
3. ローズベンガル色素の十分な注射後特定の病変体積の再現性を保証するために、血管の直径（40〜80ミクロン）に基づいて、血栓症の適切な容器を選択します。血流の方向を見て、動脈と静脈を区別：動脈は小径血管に大きな直径から移動し、静脈はより大きな直径の血管に小さいから移動します。ローズベンガルが注入されると、これは、容易に可視化することによって達成されます。
4. 次のように顕微鏡の設定を変更します。
   1. 滞留時間を増加させます。注：これは、利用される顕微鏡システムに依存して変化します。
   2. 100％にレーザーパワーを大きくしてください。
   3. 使用して1フレーム/秒で時系列画像を収集最大スキャン速度。
5. 安定した凝血塊が血管内に形成されるまでマウスをスキャンします。注：この一般的に連続スキャンの5分以内に達成される（ 図4を参照してください）。
6. ローズベンガルを用いた血栓形成の誘導後、バック解剖顕微鏡の撮像領域からマウスを取り外します。慎重に頭蓋頭蓋骨からステンレス製のリングを取り外します。出血のための頭蓋窓を調べます。出血が発生した場合は、実験を終了します。
7. 頭蓋骨の上に切開部を閉じるために、6.0モノフィラメント縫合糸を使用してください。感染を防ぐために、縫合線に沿って抗生物質軟膏を置きます。 Buprenex（0.05ミリグラム/ kg）の疼痛管理のために3日間皮下12時間毎に注入します。
8. 完全に覚醒し、自由に移動するまで麻酔から除去した後の回復室にマウスを返します。
9. 後で、さらなる調査のためにきれいなケージにマウスを返します。

5。その後の日に縦イメージング

1. その後の日後に光血栓の縦撮影を行うには、次の方法を採用しています。
   1. 方法の第1節で説明したように、マウスを麻酔。
   2. 十分な麻酔の際に、以前に掘削撮像視野を覆う皮膚を再度オープンするために、任意の残留縫合糸を除去することにより、頭皮を再オープンします。
   3. 頭蓋の上にある残りの筋膜を除去するために滅菌綿棒を使用してください。
   4. 前回の撮像視野を覆う骨に組織接着剤を使用したカスタムステンレス製リング（ 図1）を接着。
   5. マウスを安定させ、画像形成中の移動を防止するために、定位ホルダー（ 図2）環を貼付。
   6. 以前に薄く頭蓋骨の基礎となる血管系を探します。以前に誘導された血餅の存在を確認するためにFITCデキストランの尾静脈注射を使用してください。
   7. 内を閉じるために6.0モノフィラメント縫合糸を使用頭蓋骨の上cision。感染を防ぐために、縫合線に沿って抗生物質軟膏を置きます。 Buprenex（約0.05mg / kg）を、疼痛管理のために3日間皮下12時間毎に注入します。
   8. 完全に覚醒し、自由に移動するまで麻酔から除去した後の回復室にマウスを返します。

脳卒中の誘導の6検証（死後）

1. 研究の終わりに、 図5に示すように、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色を使用して、ストローク量を確認する。完全な方法は^、12に見出すことができます。

結果

この方法の目的は、561 nmのレーザー光を薄く頭蓋骨の尾静脈とその後の照明を介してRBのボーラス注射後の動物モデルにおける虚血性脳卒中（マウス、ラット）を誘導することでした。 図4の画像は、0、1、1.5、2分間の領域の照射後の単一の容器内に血栓形成の進行を示しています。血栓形成の前に容器全体はローズベンガルを流れる自由に起因白です。容器の照射誘導後そこに?...

ディスカッション

動物からヒトへの適用に実験的なストローク病態生理を変換する機能は、障害に悩まされています。しかし、このような光血栓モデルなどの動物モデルの使用は、改良されたストローク病態生理の理解と脳卒中後の神経保護を提供するための新しい治療法の探求を可能にします。光血栓モデルによって生成される小さな皮質ストロークとmicroinfarctionsは、臨床的に無症状または高い有病率を持...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
[header]
Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53
Meisinger 3.9 mm drill bit	Meisinger		(Ref#310 104 001 001 009)