Isolering af leukocytter fra det murine væv på maternel-føtal grænseflade

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Immun tolerance i graviditeten kræver, at immunsystemet hos moderen undergår markante ændringer for at acceptere og give næring fosteret udvikle. Denne tolerance er initieret under coitus, etableret under befrugtning og implantation, og opretholdes under hele graviditeten. Aktive cellulære og molekylære mediatorer af maternel-føtal tolerance er beriget på stedet for kontakt mellem føtale og maternelle væv, kendt som den maternelle-føtale interface, som omfatter moderkagen og livmoderen og decidua væv. Denne grænseflade består af stromale celler og infiltrerende leukocytter, og deres overflod og fænotypiske karakteristika ændres i løbet af graviditeten. Infiltrerende leukocytter på maternel-føtal grænseflade indbefatter neutrofiler, makrofager, dendritiske celler, mastceller, T-celler, B-celler, NK-celler og NKT-celler, der samlet udgør det lokale mikromiljø, som opretholder graviditet. En ubalance mellem disse celler eller enhver inappropriate ændring i deres fænotyper betragtes som en mekanisme for sygdom i graviditeten. Derfor studiet af leukocytter, der infiltrerer maternel-føtal interface er afgørende for at belyse de immune mekanismer, der fører til graviditetsrelaterede komplikationer. Beskrevet heri er en protokol, som anvender en kombination af forsigtig mekanisk dissociation efterfulgt af et robust enzymatisk disaggregering med et proteolytisk og collagenolytisk enzymatisk cocktail at isolere de infiltrerende leukocytter fra de murine væv ved maternel-føtal interface. Denne protokol muliggør isolering af høje antal af levedygtige leukocytter (> 70%) med tilstrækkelig konserverede antigene og funktionelle egenskaber. Isolerede leukocytter kan derefter analyseres ved adskillige teknikker, herunder immunfænotype, cellesortering, imaging, immunoblotting, mRNA-ekspression, cellekultur og in vitro funktionelle assays såsom blandede leukocyt reaktioner, proliferation eller cytotoksicitetsassays.

Immuntolerance i graviditeten er en periode, hvor markante ændringer forekommer inden immunsystemet hos moderen. Disse ændringer tillader moderen at tolerere fosteret, en semi-allogent transplantat ^1. Fosteret udtrykker faderlige større histokompatibilitetskompleks (MHC) antigener ^2, og fosterceller er blevet fundet i den maternelle cirkulation ^3; imidlertid fosteret ikke afvist ^4,5. Denne gåde er ikke fuldt forstået.

Den seneste hypotese, at maternel-føtal tolerance er skabt under coitus og befrugtning ^6,7 og vedligeholdes for at opretholde en fuld sigt graviditet ^8-10. En....

Før du arbejder med de i denne protokol prøver, skal dyr etisk godkendelse gives af den lokale Research etiske komité og Institutional Review Boards. Når du arbejder med dyreblod, celler eller farlige stoffer, som er nævnt i denne protokol, skal de korrekte biosikkerhed og laboratorieudstyr sikkerhedstiltag følges.

1. Mus Håndtering og Tissue Collection

1. Forbered en steril arbejdsstation og få sterile værktøjer til væv samling. Disse værktøjer vil omfatte store og små.......

Dissektion af murine væv fra maternel-føtal grænseflade er vist i figur 1; denne procedure omfatter åbning af bughulen (figur 1A, B), uterine horn (Figur 1C), herunder de implantationssteder (figur 1D), og indsamlingen af de uterine væv (Figur 1E), placenta (figur 1F), og decidua væv (figur 1G) til 16,5 dpc. Figur 2 viser morfologien af isolerede makrofager (F4 / 80 +) indsamles f.......

Indsamlingen af ​​sammenhængende data, der registrerer overflod og fænotypiske karakteristika infiltrerende leukocytter ved maternel-føtal interface er afgørende for at forstå patogenesen af ​​graviditetsrelaterede komplikationer. Adskillige teknikker er blevet beskrevet som letter isoleringen af infiltrerende leukocytter fra de murine væv på maternel-føtal grænseflade hele graviditeten ^{31,38,39,43-46.} Men hver teknik er forskellige, anvender forskellige enzymer eller enzymkombinationer, kræ.......

NGL blev støttet af Wayne State University Perinatal Initiative i Maternal, Perinatal og børns sundhed. Vi takker Maureen McGerty og Amy E. Furcron (Wayne State University) for deres kritisk læsning af manuskriptet.