Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Immuuntolerantie in de zwangerschap vereist dat het immuunsysteem van de moeder ondergaat opvallende veranderingen om te accepteren en te koesteren de zich ontwikkelende foetus. Deze tolerantie wordt gestart tijdens de coïtus, tijdens bevruchting en implantatie opgericht en onderhouden tijdens de zwangerschap. Actieve cellulaire en moleculaire mediatoren van tolerantie maternale-foetale worden verrijkt op de plaats van contact tussen foetale en maternale weefsels, zogenaamde maternale-foetale interface, die de placenta en de baarmoeder en deciduale weefsel omvat. Deze interface omvat stromale cellen en infiltrerende leukocyten en hun overvloed en fenotypische karakteristieken verandert in de loop van de zwangerschap. Infiltrerende leukocyten in het maternale-foetale-interface omvatten neutrofielen, macrofagen, dendritische cellen, mestcellen, T-cellen, B-cellen, NK-cellen en NKT cellen die tezamen de lokale micro-omgeving die de zwangerschap in stand te creëren. Een onbalans tussen deze cellen of inappropriate verandering in hun fenotypen wordt beschouwd als een mechanisme van ziekte tijdens de zwangerschap. Daarom is de studie van leukocyten dat de maternale-foetale-interface infiltreren is essentieel om de immune mechanismen die leiden tot zwangerschap verwante complicaties helderen. Hierin beschreven is een protocol dat een combinatie van zachte mechanische dissociatie gevolgd door een sterke enzymatische disaggregatie met een proteolytische en collagenolytische enzymatische cocktail de infiltrerende leukocyten uit de muizen weefsels te isoleren van de maternale-foetale interface gebruikt. Dit protocol maakt de isolatie van grote aantallen levensvatbare leukocyten (> 70%) met voldoende geconserveerde antigene en functionele eigenschappen. Geïsoleerde leukocyten kan vervolgens worden geanalyseerd door verscheidene technieken, waaronder immunofenotypering, celsortering, imaging, immunoblotting, mRNA expressie, celkweek en in vitro functionele testen zoals gemengde leukocyt reacties, proliferatie of cytotoxiciteit assays.

Immunotolerantie bij zwangerschap is een periode waarin kenmerkende reactie plaatsvinden het immuunsysteem van de moeder. Deze veranderingen kan de moeder naar de foetus, een semi-allogeen transplantaat ¹ tolereren. De foetus tot expressie vaderlijke major histocompatibility complex (MHC) antigenen ² en foetale cellen gevonden in de moederlijke circulatie ^3; echter de foetus niet verworpen ^4,5. Dit raadsel is niet helemaal duidelijk.

De meest recente hypothese stelt dat de moeder-foetale tolerantie wordt gemaakt tijdens de coïtus en bevruchting ^6,7 en onderhouden om een voldragen zwan....

Voor het werken met de in dit protocol genoemde monsters, moet dier ethische goedkeuring worden gegeven door de lokale Research Ethics Committee en de Institutional Review Boards. Bij het werken met dierlijk bloed, cellen, of gevaarlijke stoffen als bedoeld in dit protocol, moet de juiste bioveiligheid en laboratorium veiligheid acties worden opgevolgd.

1. Mouse Handling en Tissue Collection

1. Bereid een steriele werkplek en het verkrijgen van steriele instrumenten voor het weefsel .......

De dissectie van muizen weefsels van de maternale-foetale interface is weergegeven in figuur 1; Deze procedure omvat het openen van de peritoneale holte (Figuur 1A, B), baarmoederhoorns (figuur 1C) met de implantatieplaatsen (figuur 1D), en het verzamelen van de baarmoederweefsels (Figuur 1E), placenta (Figuur 1F), en decidua weefsels (figuur 1G) en 16,5 dpc. Figuur 2 toont de morfologi.......

Het verzamelen van consistente gegevens die de overvloed en fenotypische kenmerken van het infiltreren leukocyten registreert bij de moeder-foetale interface is van essentieel belang voor het begrijpen van de pathogenese van de zwangerschap gerelateerde complicaties. Verschillende technieken beschreven dat de isolatie van infiltrerende leukocyten uit de muizen weefsels bij maternale-foetale-interface gedurende de zwangerschap ^{31,38,39,43-46} vergemakkelijken. Echter, elke techniek verschilt, gebruikt verschill.......

NGL werd gesteund door de Wayne State University Perinatale Initiative in Maternal, Perinatale en Child Health. We dankbaar erkennen Maureen McGerty en Amy E. Comfort Suites Comfort Suites (Wayne State University) voor hun kritische lezing van het manuscript.