Isolement de leucocytes des tissus murins à l'interface materno-foetale

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

La tolérance immunitaire pendant la grossesse nécessite que le système immunitaire de la mère subit des changements distinctifs afin d'accepter et de nourrir le foetus de développement. Cette tolérance est initiée pendant le coït, établi au cours de la fécondation et l'implantation, et maintenu pendant toute la grossesse. Médiateurs actifs cellulaires et moléculaires de la tolérance foeto-maternelle sont enrichis sur le site de contact entre les tissus foetaux et maternels, connus sous le nom de l'interface materno-fœtale, qui comprend le placenta et l'utérus et des tissus déciduales. Cette interface est composée de cellules stromales et leucocytes infiltrants, et leurs caractéristiques d'abondance et phénotypiques changer au cours de la grossesse. Infiltration des leucocytes à l'interface materno-fœtale comprennent les neutrophiles, les macrophages, les cellules dendritiques, les mastocytes, les cellules T, les cellules B, les cellules NK, les cellules NKT et qui créent ensemble le micro-environnement local qui soutient la grossesse. Un déséquilibre entre ces cellules ou tout inappropaltération riée dans leurs phénotypes est considéré comme un mécanisme de la maladie pendant la grossesse. Par conséquent, l'étude des leucocytes qui infiltrent l'interface materno-fœtale est essentiel en vue d'élucider les mécanismes immunitaires qui conduisent à des complications liées à la grossesse. On décrit ici un protocole qui utilise une combinaison de dissociation mécanique douce suivie d'une décomposition enzymatique protéolytique robuste avec un cocktail enzymatique collagénolytique et pour isoler les leucocytes infiltrant des tissus murins à l'interface materno-fœtale. Ce protocole permet l'isolement d'un nombre élevé de leucocytes viables (> 70%) avec des propriétés antigéniques et fonctionnelles suffisamment conservées. Les leucocytes isolés peuvent ensuite être analysés par plusieurs techniques, y compris l'immunophénotypage, tri cellulaire, l'imagerie, immunoblotting, l'expression d'ARNm, une culture de cellules, in vitro et des essais fonctionnels tels que des réactions de leucocytes mixtes, prolifération, ou des essais de cytotoxicité.

La tolérance immunitaire à la grossesse est une période pendant laquelle se produisent les changements distincts dans le système immunitaire de la mère. Ces changements permettent à la mère de tolérer le fœtus, une greffe allogénique ^semi-1. Le fœtus exprime paternelle complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) ^2, et les cellules foetales ont été trouvés dans la circulation maternelle ^3; Cependant, le fœtus ne soit pas rejeté ^4,5. Cette énigme est pas entièrement comprise.

L'hypothèse la plus récente indique que la tolérance materno-fœtale est créé pendant le coït et la fécondation ^....

Avant de travailler avec les échantillons mentionnés dans le présent protocole, l'approbation éthique animale doit être donné par le Comité d'éthique de la recherche locale et les Institutional Review Boards. Lorsque vous travaillez avec du sang animal, cellules, ou des agents dangereux tel que mentionné dans ce protocole, les actions appropriées en matière de biosécurité et de sécurité de laboratoire doivent être respectées.

1. Manipulation Mouse et collecte de tissus.......

La dissection des tissus murins provenant de l'interface materno-fœtale est représenté sur la figure 1; Cette procédure comprend l'ouverture de la cavité peritoneale (figure 1A, B), les cornes utérines (Figure 1C), y compris les sites d'implantation (Figure 1D), et la collecte des tissus utérins (figure 1E), le placenta (Figure 1F), et des tissus déciduales (figure 1G) à 16,5 dpc. <.......

La collecte de données cohérentes qui enregistre les caractéristiques de l'abondance et phénotypiques de leucocytes infiltrants à l'interface materno-fœtale est essentielle pour comprendre la pathogenèse des complications liées à la grossesse. Plusieurs techniques ont été décrites qui facilitent l'isolement de l'infiltration des leucocytes à partir des tissus murins à l'interface materno-fœtale pendant la grossesse ^{31,38,39,43-46.} Cependant, chacune de ces techniques est dif.......

NGL a été soutenu par l'Initiative de l'Université Wayne State périnatale en maternelle, périnatale et santé de l'enfant. Nous tenons à remercier Maureen McGerty et Amy E. Furcron (Wayne State University) pour leur lecture critique du manuscrit.