Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Immuntoleranz bei Schwangerschaft erfordert, dass das Immunsystem der Mutter erfährt Scheidungsänderungen, um zu akzeptieren und zu pflegen sich entwickelnden Fötus. Diese Toleranz wird während des Koitus eingeleitet, während der Befruchtung und Implantation gegründet und während der Schwangerschaft beibehalten wird. Aktive zellulären und molekularen Mediatoren von Mutter und Fötus Toleranz werden an der Stelle des Kontaktes zwischen fetalen und mütterlichen Gewebe, wie die Mutter und Fötus-Schnittstelle, die die Plazenta und die Gebärmutter und dezidualen Gewebe enthält bekannt bereichert. Diese Schnittstelle wird von Stromazellen und infiltrieren Leukozyten besteht, und deren Fülle und phänotypischen Eigenschaften im Laufe der Schwangerschaft zu ändern. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle umfassen Neutrophile, Makrophagen, dendritische Zellen, Mastzellen, T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, die zusammen das lokale Mikroumgebung, die Schwangerschaft aufrecht zu erstellen. Ein Ungleichgewicht zwischen diesen Zellen oder jede inappropriate Veränderung ihrer Phänotypen wird als ein Mechanismus der Erkrankung in der Schwangerschaft. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten, die die Mutter und Fötus Schnittstelle infiltrieren wesentlich, um die Immunmechanismen, die schwangerschaftsbedingten Komplikationen aufzuklären. Hierin ist ein Protokoll, das eine Kombination von leichter mechanischer Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung mit einem proteolytischen und kollagenolytischen Enzymcocktail, um die Infiltration von Leukozyten aus den Mäusegeweben an der mütterlich-fötalen Grenzfläche zu isolieren, verwendet. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung der hohen Zahl von lebensfähigen Leukozyten (> 70%) mit einer ausreichend konservierten antigenen und funktionellen Eigenschaften. Isolierten Leukozyten können dann durch verschiedene Techniken, einschließlich Immunphänotypisierung Zellsortierung, Imaging, Immunoblotting-mRNA-Expression, Zellkultur und in vitro funktionelle Assays wie gemischte Leukozytenreaktionen, Proliferation oder Zytotoxizität Assays analysiert werden.

Immuntoleranz bei Schwangerschaft ist eine Periode, in Scheidungs ​​Veränderungen im Immunsystem der Mutter erfolgen. Diese Änderungen ermöglichen die Mutter auf den Fötus, eine semi-allogenen Transplantats ¹ zu tolerieren. Der Fötus drückt väterlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) -Antigene ² und fötalen Zellen im mütterlichen Kreislauf ³ gefunden worden ist; jedoch ist der Fötus nicht abgelehnt ^4,5. Dieses Rätsel ist nicht vollständig geklärt.

Die jüngste Hypothese besagt, dass Mutter und Fötus Toleranz während des Koitus erstellt und Befruchtung und ^6,7 gehalten, um eine v....

Vor der Arbeit mit den in diesem Protokoll genannten Proben müssen Tier ethische Genehmigung durch die lokalen Forschungsethikkommission und der Institutional Review Boards gegeben. Bei der Arbeit mit Tierblut, Zellen oder gefährliche Mittel, wie in diesem Protokoll erwähnt, müssen die richtige biologische Sicherheit und Laborsicherheitsmaßnahmen eingehalten werden.

1. Maus Handhabung und Gewebeentnahme

1. Bereiten Sie eine sterile Arbeitsstation und erhalten sterile Werkzeuge f.......

Die Präparation von Maus-Geweben von der mütterlich-fötalen Grenzfläche ist in Abbildung 1 gezeigt ist; Dieses Verfahren umfasst das Öffnen der Bauchhöhle (1A, B), Gebärmutterhörner (1C), die die Implantationsstellen (1D) und die Sammlung der Uterusgeweben (1E), Plazenta (1F) und Dezidua-Gewebe (1G) bei 16,5 dpc. 2 zeigt die Morphologie von isolierten Makrophagen (F4 / 80 +) aus.......

Die einheitliche Datenerhebung, die die Fülle und phänotypischen Eigenschaften der infiltrierenden Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zeichnet ist wesentlich für das Verständnis der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen. Verschiedene Techniken wurden beschrieben, dass die Isolierung der infiltrierenden Leukozyten aus den Mäusegeweben am mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft ^{31,38,39,43-46} erleichtern. Aber jede Technik unterschiedlich ist, verwend.......

NGL wurde von der Wayne State University in Perinatal Initiative von Müttern, Perinatal and Child Health. Wir danken Maureen McGerty und Amy E. Furcron (Wayne State University) für die kritische Durchsicht des Manuskripts.