L'isolamento dei leucociti di tessuti murini all'interfaccia materno-fetale

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Tolleranza immunitaria in gravidanza richiede che il sistema immunitario della madre subisce cambiamenti distintivi, al fine di accogliere e nutrire il feto in via di sviluppo. Questa tolleranza è iniziata durante il coito, stabilito durante la fecondazione e l'impianto, e mantenuto per tutta la gravidanza. Mediatori attivi cellulari e molecolari della tolleranza materno-fetale sono arricchiti nel sito di contatto tra tessuti fetali e materni, noto come l'interfaccia materno-fetale, che comprende la placenta e l'utero e tessuti deciduali. Questa interfaccia è costituito da cellule stromali e leucociti infiltranti, e le loro caratteristiche fenotipiche abbondanza e cambiano nel corso della gravidanza. Leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale includono neutrofili, macrofagi, cellule dendritiche, mastociti, le cellule T, cellule B, le cellule NK e cellule NKT che creano insieme il micro-ambiente locale che sostiene la gravidanza. Uno squilibrio tra queste cellule o qualsiasi inappropalterazione riate nei loro fenotipo è considerato un meccanismo di malattia in gravidanza. Pertanto, lo studio di leucociti che si infiltrano l'interfaccia materno-fetale è essenziale al fine di chiarire i meccanismi immunitari che portano a complicazioni legate alla gravidanza. Qui descritto è un protocollo che utilizza una combinazione di dissociazione meccanica delicata seguita da una disaggregazione enzimatica robusta con proteolitica e cocktail enzimatica collagenolitica isolare i leucociti infiltranti dai tessuti murini all'interfaccia materno-fetale. Questo protocollo consente l'isolamento di un alto numero di leucociti vitali (> 70%) con sufficientemente conservati proprietà antigeniche e funzionali. Isolati leucociti possono poi essere analizzati da diverse tecniche, tra cui immunofenotipizzazione, separazione delle cellule, l'imaging, immunoblotting, espressione di mRNA, coltura cellulare, e in vitro saggi funzionali quali reazioni contrastanti leucociti, la proliferazione, o saggi di citotossicità.

Tolleranza immunitaria in gravidanza è un periodo in cui i cambiamenti caratteristici si verificano all'interno del sistema immunitario della madre. Queste modifiche permettono alla madre di tollerare il feto, un innesto semi-allogenico ^1. Il feto esprime paterna complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) ^2, e le cellule fetali sono stati trovati nel sangue materno ^3; tuttavia, il feto non è respinta ^4,5. Questo enigma non è pienamente compresa.

L'ipotesi più recente afferma che la tolleranza materno-fetale è creato durante il coito e la fecondazione ^6,7 e mantenuto per sos....

Prima di lavorare con i campioni di cui al presente protocollo, l'approvazione etica animale deve essere dato dal Research Comitato Etico Locale e la revisione Istituzionali Boards. Quando si lavora con sangue animale, cellule, o di agenti pericolosi, come indicato in questo protocollo, le azioni di biosicurezza e di sicurezza di laboratorio adeguate devono essere seguite.

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La dissezione dei tessuti murini dall'interfaccia materno-fetale è mostrato in Figura 1; questa procedura prevede l'apertura della cavità peritoneale (Figura 1A, B), corna uterine (Figura 1C), compresi i siti di impianto (Figura 1D), e la raccolta di tessuti uterini (Figura 1E), la placenta (Figura 1F), e tessuti decidua (Figura 1G) a 16.5 dpc. La Figura 2 mostra la morfologia.......

La raccolta di dati coerenti che registra le caratteristiche fenotipiche e abbondanza di leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale è essenziale per comprendere la patogenesi delle complicanze legate alla gravidanza. Sono state descritte diverse tecniche che facilitano l'isolamento di leucociti infiltranti dai tessuti murini all'interfaccia materno-fetale durante la gravidanza ^{31,38,39,43-46.} Tuttavia, ogni tecnica è differente, utilizza enzimi o combinazioni di enzimi diversi, richied.......

NGL è stato sostenuto dalla Wayne State University perinatale Iniziativa in materna, perinatale e la salute del bambino. Noi riconosciamo con gratitudine Maureen McGerty e Amy E. Furcron (Wayne State University) per la loro lettura critica del manoscritto.