산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Published: May 21st, 2015

DOI:

10.3791/52866

Marcia Arenas-Hernandez¹, Elly N. Sanchez-Rodriguez¹, Tara N. Mial¹, Sarah A. Robertson², Nardhy Gomez-Lopez^1,3,4

¹Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, ²School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, ³Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, ⁴Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

임신에서 면역 관용은 어머니의 면역 체계가 현상 태아에 동의하고 육성하기 위해 특유의 변화를 겪는 것을 요구한다. 이 허용 오차는 성교시에 시작 Fecundation는과 주입 중 설립, 임신 동안 유지된다. 산모 - 태아 관용의 활성 세포 및 분자 매개은 태반과 자궁과 탈락 막 조직을 포함하는 산모 - 태아 인터페이스로 알려진 태아와 산모의 조직 사이의 접촉의 사이트에 충실. 이 인터페이스는, 기질 세포 및 백혈구 침윤으로 구성되고, 그 표현형 풍부하고 임신에 걸쳐 변화. 모체 - 태아의 계면에 침투 백혈구 함께 임신 지탱 로컬 미세 환경을 만들 호중구, 대 식세포, 수지상 세포, 비만 세포, T 세포, B 세포, NK 세포, 및 NKT 세포를 포함한다. 이 세포 또는 inapprop 간의 불균형자신의 표현형에 riate 변경은 임신 질병의 메커니즘을 고려된다. 따라서, 산모 - 태아 인터페이스를 침투 백혈구의 연구는 임신 관련 합병증으로 이어질 면역 메커니즘을 규명하기 위해 필수적이다. 본원에 기재된 단백질 분해 및 모체 - 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 침윤 백혈구를 분리 collagenolytic 효소 칵테일 강력한 효소 세분화이어서 부드러운 기계적 해리의 조합을 사용하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 충분히 보존 항원 및 기능적 특성을 가진 가능한 백혈구 (> 70 %)의 높은 숫자의 분리 수 있습니다. 격리 백혈구이어서 면역 표현형, 세포 분류, 영상화, 면역, mRNA 발현, 세포 배양, 및 혼합 백혈구 반응, 증식 또는 세포 독성 분석 시험 관내 기능 분석 등을 포함한 몇 가지 기술에 의해 분석 될 수있다.

특징적인 변화가 어머니의 면역 시스템 내에서 발생하는 경우 임신 면역 관용은 기간입니다. 이러한 변화는 어머니가 태아, 반 동종 이식 ^(1)을 허용 할 수 있습니다. 태아는 아버지의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)는 ^항원이, 태아 세포가 모체 순환 ^3에서 발견 된 표현; 그러나 태아는 ^4,5를 거부하지 않습니다. 이 수수께끼는 완전히 이해되지 않습니다.

가장 최근의 가설은 산모 - 태아의 허용 오차가 성교 중에 생성 및 ^6,7 Fecundation는과 만삭 임신 ^{8 ~ 10을} 유지하기 위해 유지되는 것을 말한다. 이 산모 - 태아 관용의 고장은 임신 ^10-16의 초기와 후기 단계에서 질병의 메커니즘을 고려된다. 모체 - 태아의 공차는 T 세포 (T 조절 세포, Th1 세포, TH2 세포와 Th17 세포), MAC 등 다양한 백혈구 하위 집단의 참여를 수반rophages, 호중구, 비만 세포, NK 세포, 및 NKT 세포, 수지상 세포 및 B 세포, 임신 ^15,17-19 걸쳐 밀도 및 위치 파악에 그 변화. 어머니의 면역 체계가 태아 항원 ^{(20, 21)와} 상호 ....

이 프로토콜에 언급 된 샘플 작업을 시작하기 전에, 동물의 윤리적 인 승인은 지역 연구 윤리위원회와 윤리 심의 보드에 의해 제공되어야합니다. 동물의 혈액, 세포, 또는이 프로토콜에 언급 된 유해 에이전트와 작업 할 때, 적절한 바이오 안전성 및 실험실 안전 조치가 따라야합니다.

1. 마우스의 취급 및 조직 컬렉션

멸균 워크 스테이션을 준비하고 조직 수집을 위?.......

모체 - 태아의 인터페이스에서 뮤린 조직의 절개는도 1에 도시되어있다; 이 절차는 복강 (도 1A, B), 주입 부위 (도 1d)를 포함한 자궁 뿔 (도 1C), 및 자궁 조직의 컬렉션 (도 1E), 태반 (도 1F), 및 탈락 조직을 개방 포함 16.5에서 (그림 1G)는 DPC. 그림 2는 고립 된 대 식세포의 형태를 보여줍니다 (F4 / 80 +) .......

산모 - 태아 인터페이스에 침투 백혈구의 풍요 로움과 표현형 특성을 기록하고 일관된 데이터의 수집은 임신 관련 합병증의 발병 기전을 이해하는 데 필수적이다. 몇 가지 기술은 임신 ^{31,38,39,43-46} 걸쳐 모체 - 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 백혈구 침투의 분리를 용이하게하는 기술되었다. 그러나, 각각의 기술은 다르고, 항상 분리 된 세포의 생존 능력을 지정하지 않고, 가장 중요한.......

NGL은 모자, 주 산기 모자 건강에 웨인 주립 대학 주 산기 이니셔티브에 의해 지원되었다. 우리는 기꺼이 원고의 비판적인 읽기 모린 McGerty 에이미 E. Furcron (웨인 주립 대학)을 인정합니다.

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Name	Company	Catalog Number	Comments
			Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies			(Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin			(BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer			(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
			Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope

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