Isolering av leukocyttene fra Murine Vev på Maternal Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Immuntoleranse i svangerskapet krever at immunforsvaret til mor gjennomgår karakteristiske endringer for å akseptere og gi næring til fosteret. Denne toleransen er initiert under samleie, etablert under fecundation og implantasjon, og vedlikeholdes gjennom hele svangerskapet. Aktive cellulære og molekylære formidlere av maternal-føtal toleranse er beriket på kontaktstedet mellom foster eller mor vev, kjent som mor til foster grensesnitt, som inkluderer morkaken og livmor og Deciduale vev. Dette grensesnittet består av stromale celler og infiltrere leukocytter, og deres overflod og fenotypiske egenskaper endre seg i løpet av svangerskapet. Infiltrere leukocytter ved maternal-føtal grensesnittet inkluderer nøytrofile, makrofager, dendrittiske celler, mastceller, T-celler, B-celler, NK-celler, og NKT celler som til sammen skaper den lokale mikro-miljøet som opprettholder svangerskapet. En ubalanse mellom disse celler eller ethvert inappropmessig endring i deres fenotyper er ansett som en mekanisme for sykdom i svangerskapet. Derfor er studiet av leukocytter at infiltrere maternal-føtal grensesnitt viktig for å belyse immunmekanismer som fører til svangerskapsrelaterte komplikasjoner. Beskrevet her er en protokoll som bruker en kombinasjon av milde mekanisk dissosiasjon etterfulgt av en robust enzymatisk disaggregering med et proteolytisk og kollagenolytisk enzymatisk cocktail å isolere infiltrere leukocytter fra murine vev ved maternal-føtal grensesnitt. Denne protokollen tillater isolering av et høyt antall levedyktige leukocytter (> 70%) med tilstrekkelig konserverte antigene og funksjonelle egenskaper. Isolerte leukocytter kan deretter bli analysert ved hjelp av flere teknikker, inkludert immunfenotyping, cellesortering, bildebehandling, immunoblotting, mRNA-ekspresjon, cellekultur, og in vitro funksjonelle forsøk slik som blandede leukocyttkultur-reaksjon, proliferasjon eller cytotoksisitetsanalyser.

Immuntoleranse i svangerskapet er en periode da karakteristiske endringer forekommer i immunforsvaret til mor. Disse endringene gjør at moren til å tolerere fosteret, en semi-allogen pode ^en. Fosteret uttrykker fars hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) antigener ^to, og føtale celler er funnet i morens sirkulasjon ^3; imidlertid er fosteret ikke avvises ^4,5. Dette gåte er ikke fullt ut forstått.

Den siste hypotesen sier at maternal-føtal toleranse er opprettet under samleie og fecundation ^6,7 og vedlikeholdes for å opprettholde en full-term graviditet ^8-10. En oppsplitting....

Før arbeider med prøvene nevnt i denne protokollen, må dyret etisk godkjenning gis av den lokale forskningsetiske komité og Institutional Review Boards. Når du arbeider med dyreblod, celler, eller farlige stoffer som er nevnt i denne protokollen, må de riktige biologisk og laboratorie sikkerhetstiltak følges.

1. Mouse Håndtering og Tissue Collection

1. Forbered en steril arbeidsstasjon og få sterile verktøy for vev samling. Disse verktøyene vil omfatte store og små kirurg.......

Disseksjon av murine vev fra mor til foster grensesnittet er vist i figur 1; denne fremgangsmåten omfatter å åpne bukhulen (figur 1 A, B), uterine horn (figur 1C), inkludert implantasjoner (figur 1D), og innsamling av uterusvev (figur 1E), placenta (figur 1F), og Deciduale vev (figur 1G) ved 16,5 DPC. Figur 2 viser morfologi av isolerte makrofager (F4 / 80 +) samlet inn fra Deciduale.......

Samlingen av konsistente data som registrerer overflod og fenotypiske egenskaper ved infiltrere leukocytter ved maternal-føtal grensesnittet er avgjørende for å forstå patogenesen av svangerskapsrelaterte komplikasjoner. Flere teknikker har blitt beskrevet som lette isolering av infiltrerende leukocytter fra murine vev ved maternal-føtal grensesnitt gjennom hele svangerskapet ^{31,38,39,43-46.} Men hver teknikk er forskjellig, bruker ulike enzymer eller enzym kombinasjoner, krever forskjellige dissosiasjon .......

NGL ble støttet av Wayne State University Perinatal Initiative i Maternal, Perinatal and Child Health. Vi ønsker å takke for Maureen McGerty og Amy E. Furcron (Wayne State University) for deres kritisk lesing av manuskriptet.