Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Tolerância imunológica durante a gravidez requer que o sistema imunológico da mãe sofre alterações distintas, a fim de aceitar e nutrir o feto em desenvolvimento. Essa tolerância é iniciada durante o coito, estabelecida durante a fecundação e implantação, e mantida durante toda a gravidez. Mediadores celulares e moleculares activas de tolerância materno-fetal são enriquecidas no local de contacto entre os tecidos fetal e materno, conhecida como a interface materno-fetal, o que inclui a placenta e o útero e tecidos deciduais. Esta interface é composto de células do estroma e os leucócitos que se infiltram, e as suas características fenotípicas e abundância alterar no decorrer da gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal incluem neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células mastro, células T, células B, células NK, células NKT e que em conjunto, criam o micro-ambiente local que sustenta a gravidez. Um desequilíbrio entre essas células ou qualquer inappropriate alteração nos seus fenótipos é considerado um mecanismo de doença na gravidez. Portanto, o estudo de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial, a fim de elucidar os mecanismos imunológicos que levam a complicações relacionadas com a gravidez. Descreve-se aqui um protocolo que utiliza uma combinação de dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta com um cocktail enzimática proteolítica e colagenolítica para isolar os leucócitos que se infiltram nos tecidos de murino na interface materno-fetal. Este protocolo permite o isolamento de um elevado número de leucócitos viáveis ​​(> 70%) com propriedades antigénicas e funcionais suficientemente conservadas. Os leucócitos isolados podem então ser analisados ​​por várias técnicas, incluindo imunofenotipagem, separação de células, imagiologia, immunoblotting, a expressão do mRNA, cultura de células, e em ensaios funcionais in vitro tais como reacções de leucócitos mistos, proliferação ou ensaios de citotoxicidade.

Tolerância imunológica em gestação é um período em que ocorrem alterações distintas dentro do sistema imunológico da mãe. Estas mudanças permitem que a mãe de tolerar o feto, um enxerto alogênico ^semi-1. O feto expressa complexo principal de histocompatibilidade paterna (MHC) ^2, e as células fetais têm sido encontrados na circulação materna ^3; Contudo, o feto não seja rejeitada ^4,5. Este enigma não é totalmente compreendido.

A hipótese mais recente indica que a tolerância materno-fetal é criado durante o coito e fecundação ^6,7 e mantido para manter uma gravidez completa ^8-10.

Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética animal deve ser dada pelo Comitê de Ética em Pesquisa local e os institucionais Review Boards. Ao trabalhar com sangue animal, células ou agentes perigosos, como mencionado neste protocolo, as ações de biossegurança e segurança laboratoriais adequadas devem ser seguidas.

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A dissecação de tecidos de murino a partir da interface materno-fetal é mostrado na Figura 1; este procedimento inclui a abertura da cavidade peritoneal (Figura 1A, B), cornos uterinos (Figura 1C), incluindo os locais de implantação (Figura 1D), e a recolha dos tecidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), e tecidos deciduais (Figura 1G) em 16,5 dpc. A Figura 2 mostra a morfo.......

A coleta de dados consistentes que registra as características fenotípicas e abundância de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial para a compreensão da patogênese das complicações relacionadas com a gravidez. Foram descritas várias técnicas que facilitam o isolamento de leucócitos de infiltração dos tecidos murinos na interface materno-fetal durante a gravidez ^{31,38,39,43-46.} No entanto, cada técnica é diferente, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferente.......

NGL foi apoiado pela Iniciativa Universidade Wayne State Perinatal em Saúde Materna, Perinatal e Saúde da Criança. Agradecemos Maureen McGerty e Amy E. Furcron (Wayne State University) para sua leitura crítica do manuscrito.