Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

Published: May 21st, 2015

DOI:

10.3791/52866

Marcia Arenas-Hernandez¹, Elly N. Sanchez-Rodriguez¹, Tara N. Mial¹, Sarah A. Robertson², Nardhy Gomez-Lopez^1,3,4

¹Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, ²School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, ³Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, ⁴Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

La tolerancia inmunológica en el embarazo requiere que el sistema inmunológico de la madre experimenta cambios distintivos para aceptar y nutrir al feto en desarrollo. Esta tolerancia se inicia durante el coito, establecido durante la fecundación y la implantación, y se mantiene durante todo el embarazo. Mediadores celulares y moleculares activos de la tolerancia materno-fetal se enriquecen en el sitio de contacto entre los tejidos fetales y maternas, conocidos como la interfaz materno-fetal, que incluye la placenta y el útero y los tejidos deciduales. Esta interfaz se compone de las células del estroma y leucocitos infiltrantes, y sus características fenotípicas de abundancia y cambia en el transcurso del embarazo. Leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal incluyen neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, mastocitos, células T, células B, células NK, las células NKT y que juntos crean el micro-entorno local que sustenta el embarazo. Un desequilibrio entre estas células o cualquier inappropalteración piados en sus fenotipos se considera un mecanismo de la enfermedad en el embarazo. Por lo tanto, el estudio de los leucocitos que se infiltran en la interfase materno-fetal es esencial con el fin de dilucidar los mecanismos inmunológicos que conducen a complicaciones relacionadas con el embarazo. Descrito en el presente documento es un protocolo que utiliza una combinación de disociación mecánica suave seguido por una desagregación enzimática robusto con una proteolítica y cóctel colagenolıtica enzimática para aislar los leucocitos infiltrantes de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal. Este protocolo permite el aislamiento de un gran número de leucocitos viables (> 70%) con propiedades antigénicas y funcionales suficientemente conservadas. Leucocitos aislados pueden ser analizados mediante varias técnicas, incluyendo la inmunofenotipificación, clasificación de células, formación de imágenes, inmunotransferencia, la expresión de ARNm, cultivo celular, y en ensayos funcionales in vitro tales como reacciones mixtas de leucocitos, la proliferación, o ensayos de citotoxicidad.

La tolerancia inmune durante el embarazo es un período en que se producen cambios distintivos en el sistema inmunológico de la madre. Estos cambios permiten a la madre para tolerar el feto, un injerto alogénico ^semi-1. El feto expresa paternal complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) antígenos de ^2, y las células fetales se han encontrado en la circulación materna ^3; sin embargo, el feto no se rechaza ^4,5. Este enigma no se entiende completamente.

La hipótesis más reciente afirma que se crea la tolerancia materno-fetal durante el coito y su fecundación ^6,7 y mantenido para sostener....

Antes de trabajar con las muestras mencionadas en este protocolo, la aprobación ética animal debe ser dada por el Comité de Ética Local de Investigación y las Juntas de Revisión Institucional. Cuando se trabaja con sangre animal, células o agentes peligrosos que se mencionan en este protocolo, las medidas de bioseguridad y seguridad de laboratorio adecuados se deben seguir.

1. Manejo del ratón y Tejidos Colección

Preparar una estación de trabajo estéril y obtener herram.......

La disección de los tejidos murinos de la interfaz materno-fetal se muestra en la Figura 1; Este procedimiento incluye la apertura de la cavidad peritoneal (Figura 1A, B), cuernos uterinos (Figura 1C), incluyendo los sitios de implantación (Figura 1D), y la colección de los tejidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), y los tejidos deciduales (Figura 1G) a 16,5 dpc. La Figura 2

La recogida de datos consistentes que registra las características de abundancia y fenotípicas de los leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal es esencial para la comprensión de la patogénesis de las complicaciones relacionadas con el embarazo. Varias técnicas se han descrito que facilitan el aislamiento de la infiltración de leucocitos de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal durante el embarazo ^{31,38,39,43-46.} Sin embargo, cada técnica es diferente, utiliza enzimas o combinac.......

NGL fue apoyado por la Iniciativa Universitaria Perinatal Wayne State en maternas, perinatales y Salud Infantil. Agradecemos Maureen McGerty y Amy E. Furcron (Wayne State University) por su lectura crítica del manuscrito.

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Name	Company	Catalog Number	Comments
			Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies			(Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin			(BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer			(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
			Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope

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