Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.
Immun tolerans under graviditet kräver att immunsystemet hos modern genomgår distinkta förändringar för att acceptera och vårda det växande fostret. Denna tolerans initieras under samlag, etablerades under befruktning och implantation, och underhållas under hela graviditeten. Aktiva cellulära och molekylära mediatorer av moder till foster tolerans berikas på platsen för kontakt mellan foster och moderns vävnader, känd som moder till foster gränssnitt, som omfattar moderkakan och livmoder och decidual vävnader. Detta gränssnitt består av stromaceller och infiltrerande leukocyter och deras förekomst och fenotypiska egenskaper förändras under loppet av graviditeten. Infiltrerande leukocyter på moder och foster gränssnitt inkluderar neutrofiler, makrofager, dendritiska celler, mastceller, T-celler, B-celler, NK-celler och NKT-celler som tillsammans skapar den lokala mikromiljön som upprätthåller graviditet. En obalans mellan dessa celler eller någon inappropriate förändring i sina fenotyper betraktas som en mekanism av sjukdom under graviditet. Därför är nödvändig för att klarlägga de immunmekanismer som leder till graviditetsrelaterade komplikationer studiet av leukocyter som infiltrerar den moder och foster gränssnitt. Beskrivet häri är ett protokoll som använder en kombination av försiktig mekanisk dissociation följt av en robust enzymatisk uppdelning med ett proteolytiskt och kollagenolytisk enzymcocktail för att isolera de infiltrerande leukocyter från de murina vävnader vid moder och foster gränssnitt. Detta protokoll möjliggör för isolering av ett stort antal viabla leukocyter (> 70%) med tillräckligt konserverade antigeniska och funktionella egenskaper. Isolerade leukocyter kan sedan analyseras av flera tekniker, innefattande immunfenotypning, cellsortering, avbilda, immunoblotting, mRNA-uttryck, cellkultur och in vitro funktionella analyser såsom blandade leukocyt reaktioner, spridning eller cytotoxicitetsanalyser.
Immun tolerans under graviditeten är en period då distinkta förändringar inom immunsystemet hos modern. Dessa förändringar gör det möjligt för mamman att tolerera fostret, en semi-allogent transplantat 1. Fostret uttrycker fader större histokompatibilitetskomplex (MHC) -antigener 2, och fetala celler har hittats i moderns cirkulation 3; dock fostret inte avvisas 4,5. Denna gåta är inte helt klarlagd.
Den senaste hypotesen säger att moder till foster tolerans skapas under samlag och betäckning 6,7 och underhållas för att upprätthålla en fullgången graviditet 8-10. En uppdeln....
Innan du arbetar med de prover som nämns i detta protokoll, måste djur etiskt godkännande ges av den lokala forskningsetiska kommittén och institutionella prövningsnämnder. När du arbetar med djurblod, celler, eller farliga medel som nämns i detta protokoll, måste de rätta biosäkerhet och laboratorie säkerhetsåtgärder följas.
1. Mus Hantering och Tissue Collection
Dissektion av murina vävnader från moder till foster gränssnittet visas i figur 1; Detta förfarande innefattar att öppna bukhålan (Figur 1A, B), livmoderhorn (Figur 1C) inklusive implantationsställen (Figur 1D), och insamling av livmodervävnad (Figur 1E), placenta (figur 1F), och decidual vävnader (Figur 1G) vid 16,5 DPC. Figur 2 visar morfologin av isolerade makrofager (F4 / 8.......
Insamlingen av konsekventa data som registrerar överflöd och fenotypiska egenskaper hos infiltrerande leukocyter på moder och foster gränssnitt är nödvändig för att förstå patogenesen av graviditetsrelaterade komplikationer. Flera tekniker har beskrivits som underlättar isoleringen av infiltrerande leukocyter från de murina vävnader vid den moder och foster gränssnitt hela graviditeten 31,38,39,43-46. Men varje teknik är annorlunda, använder olika enzymer eller enzymkombinationer, kräver olik.......
NGL stöddes av Wayne State University Perinatal initiativet i Maternal, perinatal och barns hälsa. Vi tackar Maureen McGerty och Amy E. Furcron (Wayne State University) för deras kritiska läsning av manuskriptet.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Magentic Cell Separation | |||
MS Columns | |||
Cell Separator | |||
30μm pre separation filters | |||
Multistand | |||
15mL safe lock conical tubes | |||
MACS Buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
Reagents | |||
Anti-mouse CD16/CD32 | |||
Anti-mouse extracellular antibodies | (Table 1) | ||
Sodium azide | |||
Bovine serum albumin | (BSA) | ||
LIVE/DEAD viability dye | |||
Fixation buffer solution | |||
FACS Buffer | (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2) | ||
Trypan Blue Solution 0.4% | |||
Fetal bovine serum | |||
Additional Instruments | |||
Incubator with shaker | |||
Flow cytometer | |||
Centrifuge | |||
Vacuum system | |||
Incubator | |||
Water bath | |||
Cell counter | |||
Microscope |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved