Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.
Gebelikte immün tolerans annenin bağışıklık sistemi gelişmekte fetusun kabul ve beslemek için ayırt edici değişikliklere uğrar gerektirir. Bu hoşgörü, cinsel birleşme sırasında başlatılan döllenmenin ve implantasyon sırasında kurulan ve gebelik boyunca korunur. Maternal-fetal hoşgörü Aktif hücresel ve moleküler arabulucular plasenta ve uterus ve desidual dokuları içeren maternal-fetal arayüzü olarak bilinen fetal ve maternal dokular arasındaki temas yerinde zenginleştirilmiştir. Bu arayüz, stromal hücreleri ve infıltre edici lökositler oluşur ve bunların bolluğu ve fenotipik özellikleri gebelik boyunca değişir. Maternal fetal arayüzünde infiltre eden lökositlerin gebeliği ayakta yerel mikro-ortam yaratmak nötrofiller, makrofajlar, dendritik hücreler, mast hücreleri, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve NKT hücrelerini içerir. Bu hücrelerin ya da herhangi bir inapprop arasındaki bir dengesizlikOnların fenotipleri de yaklaşımlarına yön değişiklik gebelikte hastalığın mekanizmasını kabul edilir. Bu nedenle, maternal-fetal arayüz sızmak lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonlara neden bağışıklık mekanizmaları aydınlatmak için esastır. Burada tarif edilen bir proteolitik ve maternal-fetal arayüzünde fare dokulardan sızan lökositlerin izole etmek kolajenolitik enzimatik kokteyl ile sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif mekanik ayrışma bir arada kullanan bir protokoldür. Bu protokol, yeterince korunmuş antijen ve fonksiyonel özelliklere sahip uygun bir lökosit (>% 70) yüksek sayıda izolasyon sağlar. İzole edilmiş lökositlerin daha sonra immunofenotip hücre sıralama, görüntüleme, immunoblotting, mRNA ekspresyonu, hücre kültürü, ve karışık bir lökosit reaksiyonları, proliferasyon, sitotoksisite veya tahlilleri gibi in vitro fonksiyonel deneyleri de dahil olmak üzere çeşitli teknikler ile analiz edilebilir.
Ayırt edici değişiklikler annenin bağışıklık sisteminde ortaya çıktığında gebelik bağışıklık tolerans bir dönemdir. Bu değişiklikler anne fetus, yarı allojenik greft 1 tahammül sağlar. Fetus baba büyük doku uygunluk kompleksi (MHC) 2 antijenleri ve fetal hücreler anne dolaşımında 3 bulunmuştur ifade eder; Ancak, fetus, 4,5 vazgeçmiş değiliz. Bu muamma tam olarak anlaşılmış değildir.
En son hipotez maternal-fetal tolerans cinsel birleşme sırasında oluşturulan ve 6,7 döllenme ve tam süreli gebeliği 8-10 sürdürmek için muhafaza belirtiyor. Bu maternal-fetal tolerans dökümü geb....
Bu protokolde belirtilen numuneler ile çalışmaya başlamadan önce, hayvan etik onay Yerel Araştırma Etik Kurulu ve Kurumsal Gözden Kurulları tarafından verilmelidir. Hayvan kanı, hücreleri, ya da bu protokolde belirtildiği gibi tehlikeli maddelerle çalışırken, uygun biyogüvenlik ve laboratuvar güvenliği eylemleri takip edilmelidir.
1. Fare Taşıma ve Doku Koleksiyonu
maternal-fetal arayüzü fare dokuların diseksiyonu Şekil 1'de gösterilmiştir; Bu prosedür, periton boşluğu (Şekil 1A, B), emplantasyon yerlerinin (Şekil 1D) içeren rahim boynuzları (Şekil 1C) ve uterus dokularının toplama (Şekil 1E), plasenta (Şekil 1F) ve desidual dokuları açıklığı kapsamaktadır 16.5 at (Şekil 1G) DPC. Şekil 2 izole makrofajlar morfolojisi.......
maternal-fetal arayüzünde sızan lökositlerin bolluğu ve fenotipik özelliklerini kaydeden tutarlı veri toplanması gebelikle ilgili komplikasyonlar patogenezini anlamak için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik 31,38,39,43-46 boyunca anne-fetal arayüzünde Fare dokularından elde lökositlerin infiltre izolasyonunu kolaylaştırmak olduğu tarif edilmiştir. Ancak, her teknik farklıdır, her zaman izole hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzimler veya enzim kombinasyonları fark.......
NGL Anne, Perinatal ve Çocuk Sağlığı Wayne State Üniversitesi Perinatal Girişimi tarafından desteklenmiştir. Biz minnetle yazının eleştirel okuma Maureen McGerty ve Amy E. Furcron (Wayne State Üniversitesi) kabul eder.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Magentic Cell Separation | |||
MS Columns | |||
Cell Separator | |||
30μm pre separation filters | |||
Multistand | |||
15mL safe lock conical tubes | |||
MACS Buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
Reagents | |||
Anti-mouse CD16/CD32 | |||
Anti-mouse extracellular antibodies | (Table 1) | ||
Sodium azide | |||
Bovine serum albumin | (BSA) | ||
LIVE/DEAD viability dye | |||
Fixation buffer solution | |||
FACS Buffer | (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2) | ||
Trypan Blue Solution 0.4% | |||
Fetal bovine serum | |||
Additional Instruments | |||
Incubator with shaker | |||
Flow cytometer | |||
Centrifuge | |||
Vacuum system | |||
Incubator | |||
Water bath | |||
Cell counter | |||
Microscope |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved