Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme

Özet

Biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için bir immünohistokimya protokol açıklar. Bu protokol bilişsel karakterize hem genetik ya da farmakolojik fare modellerine uygulanabilir.

Özet

Fosforile ekstraselüler regüle kinaz (pERK) uyarılması öğrenme bağımlı nöronal aktivasyon güvenilir bir moleküler okuma olduğunu. Burada, biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için pERK immünhistokimya protokol açıklar. Fareler, otizm spektrum bozuklukları modeli (ASD) Özellikle, Morris su labirenti Engrailed-2 nakavt (MWM, klasik hipokampus bağımlı öğrenme görev) ^{- (- /} En2) aşağıdaki nöronal aktivasyon incelemek için pERK immün kullanılır. Vahşi tip (WT) kontrol ile karşılaştırıldığında, En2 ^{- / -} fareler MWM önemli uzamsal öğrenme yetersizlik göstermiştir. WT hayvanlara kıyasla, farelerin ^{- / -} MWM sonra, pERK pozitif nöronların sayısında anlamlı bir fark, belirli hipokampal EN2 bölgesinin alt alanlarında tespit edilmiştir. Böylece, bizim protokol sağlam farklılıkları tespit edebilirASD bir fare modelinde hipokampus bağımlı öğrenme bozukluğu ile ilişkili pERK-pozitif nöronlar. Daha genel olarak, protokol bilişsel bozukluklar ile karakterize edici özelliği, her iki genetik ya da farmakolojik fare modellerinde hipokampal nöron aktivasyon profilini araştırmak için uygulanabilir.

Giriş

Nörogelişimsel bozukluklar gibi merkezi sinir sistemi (MSS) gelişmesi ve olgunlaşması sırasında erken rahatsız olduğu Down sendromu, frajil X sendromu (FXS), Rett sendromu, nörofibromatozis, yumrulu skleroz ve ASD gibi hastalıkların geniş ve heterojen bir grup içerir Prenatal dönem ^1. Bu gelişimsel beyin işlev bozuklukları motor fonksiyon, dil, öğrenme ve bellek süreci üzerinde derin, yaşam boyu etkilere neden olabilir. Genetik ve çevresel faktörlerin bir bolluk son yıllarda ^2,3 sırasında nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde suçlanmıştır. Klinik fenotip altında yatan moleküler mekanizmalar halen bilinmemektedir bile, yukarıda belirtilen bulgular, bu hastalıkların birkaç fare modellerinin geliştirilmesi sağladı. Öğrenme ve hafıza noksanlıkları gibi ^+/- tsc1 ^+/-, TSC2 olarak, bu fare modellerinde bir dizi tespit edilmiştir,NF1 ^+/- ve En2 ^{- / -} fareler ^2,4-7. Nörogelişimsel bozuklukların alanında önemli bir zorluk hücresel ve moleküler süreçler bellek yatan ve disfonksiyonu öğrenme belirlenmesidir. Öğrenme ve bellek sırasında aktive Seçilen sinyal yolları spesifik genlerin transkripsiyonunu neden ve sonuç olarak de novo protein sentezinin yol açabilir. Hemen-Erken genler, (bacakları) aktivasyonu ve protein bağımlı sinaptik değişiklikler hızla nöronal aktivite ve davranışsal eğitim ^8,9 yanıt olarak beyin nöronlarının indüklenir.

Nörofibromin içeren sinyal yolları içinde Açıkları nörogelişimsel bozukluklarda bozulmuş öğrenme ile ilişkili bulunmuştur. Nörofibromin olan mutasyon nörofibromatozis tip 1, karmaşık genetik sendrom sinir sistemi tümörleri, davranışsal ve motor gecikme ve bilişsel DISA ile karakterizedir neden olur NF1 geninin ürünüdürhastanın talimatları ^10. Önleyici nöronlarla sınırlı NF1 silinmesi için heterozigoz olan fare, MWM ^5,11,12 uzun süreli potansiyasyon erken faz (LTP), hem de tehlikeye uzamsal öğrenme eksiklikler göstermektedir. İlginç olarak, bu fare modelinde NF1 eksikliği artan ERK fosforilasyonu ve son olarak bu nöronların ⁵ GABA serbest anormal bir artışa yol açar, öğrenme sırasında inhibitör Ras sinyallemesinin bir aşırı aktivasyonuna yol açar.

Bu bulgulara dayanarak, davranış görevler sonrasında nöronal aktivitenin görselleştirme nörogelişimsel hastalıklarda rol oynayan spesifik devreleri yeniden bir yol gösterir. Burada açıklanan immünohistokimyası protokolü değerlendirmek ve bilişsel bozukluklar ile ASD fare modelinde MWm aşağıdaki hipokampal ERK fosforilasyon düzeylerini ölçmek hedefliyor. MWM yaygın kemirgenler ^13,14 hipokampal bağımlı uzaysal öğrenme ve hafıza araştırmak için kullanılır yedekleyin. Biz ERK öğrenme ve bellek oluşumu ¹⁵ önemli bir role sahip olduğu gösterilmiştir beri görev bağımlı hipokampal öğrenme moleküler okuma olarak ERK fosforilasyonu kullanmaya karar. Ayrıca, ERK yolu, geliştirme, görsel korteks ¹⁶ deneyime bağlı plastisite için gereklidir. Son olarak, MSS gösteride iki ERK izoformu (ERK2) birini eksik fareler ERK sinyal gibi ASD olarak nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde kritik bir rol oynayabileceğini belirten, bilişsel, duygusal ve sosyal davranışlar ¹⁷ anomalileri kutladı.

Nöro hastalıklar açısından bir model olarak farenin ^{(- / -} En2) Biz Engrailed 2 nakavt kullanılır. En2 ^{- / -} fareler ön beyin internöronlar ¹⁸ kaybı dahil anatomik ve davranışsal "ASD gibi" özellikleri, ASD-ilişkili genlerin ¹⁹ azaltılmış ifade göstermek, sosyallik azaldığı ve bozulmuş bilişsel esneklik ^6,7,20. Mekansal Learning ve MWM tespit edilenler gibi hafıza kusurları, EN2 ​​özellikle sağlam ^{- / -} fareler ^6,7 ve ASD hastalarında ²¹ gözlenen bilişsel bozukluklar ile ilgili olabilir. ^{- / -} Yetişkin farelerde ⁷ Ayrıca, MWM bozulmuş normal süreçlerde indirgenmiş nörofibromin ekspresyonu ile bağlantılı ve EN2 arasında hilusunda pERK düzeylerinde artış olduğunu göstermiştir. İşte biz bu ASD fare modelinde MWm aşağıdaki pERK immunohistokimyasal karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Protokol

Tüm deneyler Avrupa Topluluğu Direktifi 2010/63 / AB ile uyumlu yapılmıştır ve İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan Bakımı, Konut ve Tedavisi

1. İlgili kurum hayvan bakım yönergelerine uygun olarak fareleri kullanarak tüm deneysel protokolleri gerçekleştirin.
2. Yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde hayvanları korumak.
3. Ev talaş ve yatak malzemesi ile standart boyutlu polikarbonat fare kafeslerinde 2-4 gruplar, fareler haftada değişti.
4. Hastalığa yatkınlık nörogelişimsel bozuklukların farklı fare modellerinde yaş ve cinsiyet ile değişebilir, çünkü yaş ve cinsiyet uyumlu fareler kullanın.
5. Istatistiksel olarak anlamlı (davranışsal çalışma için genotip başına 10 fare ve immünohistokimya deney için genotip için 4 farelik bir minimum) ulaşmak için hayvan uygun sayıda seçin.

2. Morris Water Maze (MWM)

1. Bir Genelge Tank (çapı 100 cm, yüksekliği 50 cm) kullanın.
   1. Tankın etrafına oda bölücüler bazı görsel ipuçları yerleştirin.
   2. Dört hayali kadranın birinin merkezinde sabit bir yerde tankın içine 10 cm çapında bir platform yerleştirin. Tüm eğitim oturumlarında tüm çalışmalar için aynı kadranda gizli platformu tutun.
   3. Platform su yüzeyinden 1 cm kadar musluk suyu ile havuz doldurun. Dengelenmesi su sıcaklığı 22 ° C'ye yakın olmalıdır; Bu adımı birkaç saat sürebilir. Su sıcaklığını dengeye için gereken süreyi kısaltmak için, sıcak su eklenir.
   4. Su opak hale getirmek için beyaz, toksik olmayan boya yaklaşık 1.5-2 L ekleyin.
2. Parça Toplama İşlemi
   1. Standart CCD kamera ve video kurulları ile MWm adlı izleme sistemi kurun. Böyle yol uzunluğu gibi çeşitli değişkenler izlemek ve analiz etmek için bir video izleme sistemi seçin escape gecikme ve zaman her kadranda geçirdi.
   2. Dört kadranda arenada bölün ve canlı izleme hayvanlar ve arka plan arasındaki optimum kontrast sağlamak için algılama ayarlarını.
   3. Platform bölgeyi belirtin.
   4. 60 sn maksimum deneme süresini ayarlayın.
3. MWM Testi
   1. Davranış testleri öncesinde, farelere onlar havuz ya da mekansal ipuçları göremiyorum bir alanda 20-25 dakikalık bir adaptasyon dönemi sağlar.
   2. (Aralarında 20-30 dk aralıklarla, günde iki ardışık denemeler) 9 gün boyunca her fare eğitin.
   3. Bilgisayar ve fotoğraf makinesini açın ve video izleme sistemi yazılımını başlatmak.
   4. Kendi kuyruğundan fare atın ve baş dört başlangıç ​​pozisyonları (kuzey, güney, doğu, batı) birinden başlayarak, havuz tarafına doğru işaret ile, suya koyun. Her fare için, başlama pozisyonu ve farklı çalışmalar boyunca pseudorandomized olmalıdır.
   5. Fare yüzmek edelim ve platf arama60 saniyelik bir süre için biçiminde olabilecektir. Hayvan platformu ulaştığında, 20 saniye platformda kalmak için izin verir.
   6. Fare bu süre içinde platformu bulmak için başarısız olursa, nazikçe kuyruğunu tutarak, platforma fare rehberlik ve 20 saniye boyunca orada kalmak için izin verin. Hayvan hepsi iki denemeler tamamlandıktan sonra, bir havlu ile kurulayın ve kafes içine geri koymak.
   7. Eğitim süresinin her gün, aynı prosedürü (adımları 2.3.4-2.3.6) tekrarlayın.
   8. Geçen eğitim iz gün sonra 9 prob testi yapın.
   9. Havuzdan platformu çıkarın.
   10. Fare yüzmek edelim ve 60 saniye maksimum platformu için arayın.
   11. Periyodik olarak, aynı (22 ° C) olmalıdır, böylece su sıcaklığını kontrol edin ve havuz temizlemek.

Perfüze Animals Bölüm 3. hazırlanması

1. MWM sonunda fareler kurban. Genotip başına dört fare euthaniz öncesinde anestezi gerekiryerel ve uluslararası kılavuzlara göre Ation.
2. (Kanama izin vermek için bir makas auriclewith doğru kesilir ve serpmek için sol ventrikül içine, bir kelebek kanül tanıtmak) transkardiyal hayvan serpmek 10-15 PBS içinde% 4 paraformaldehid, ardından fosfat tamponlu tuzlu su, 4-5 dakika boyunca (PBS) ile dk ^22.
3. Inceleyin ve en az 12 saat süre ile 4 ° C 'de% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası sabitleyin.
4. Dilimleme için gerekli olana değin 4 ° C'de 15 0.1 M PBS,% 0.02 sodyum azid ilave edildi ve deposu ihtiva eden 50 ml polistiren konik tüplerde beyinleri yerleştirin.
5. Kes ve vibratome kesme önce beyincik çıkarın.
6. Vibratome sahibi plaka üzerine, yapıştırıcı kullanarak, kesme site beyin dik Tutkal.
7. Uygun vibratome üzerine, dorsal hipokampusun boyunca seri sırayla, 20-40 mikron kalınlığında koronal bölüme beyin kesin.
8. Bir boya fırçası ile vibratome dilim toplayın ve 2 aktarmakHer bir kuyu için 0.1 M PBS içinde 1 ml ihtiva eden 4, çok-yuvalı plaka.
9. 4 ºC PBS içinde% 0.02 Sodyum Azid içinde PBS içinde kısa vadede veya uzun vadede mağaza bölümleri (doku kadar bir yıl süreyle kullanılmış olabilir).

4. İmmünhistokimya

1. Aktarım her bir kuyu için, 0.1 M 500 ul PBS içeren 24 çok oyuklu bir plakaya her bir fare için 3-5 dorsal hipokamp bölümleri.
2. 0.1 M PBS içinde 500 ul (5 dakika, hafifçe çalkalanarak 3 kez) ile her yuva içinde yer alan bölümleri yıkayın.
3. Hafifçe çalkalama ile 20 dakika boyunca PBS içinde% 1 _H2 O ₂ bölümleri inkübe edilerek, bir endojen peroksidaz etkinliğini Quench.
4. Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın.
5. Doku geçirgenliği: PBS içinde% 0.2 Triton X-100, 5 dakika için bölümler inkübe edin.
6. Yukarıdaki adımlarda (4.4; 4.5) içinde, (numbe tüm deney için yeterli engelleme tamponu (PBS içinde% 10 keçi serumu ve% 0.1 Triton-X100) yapmakbölümlerin R x 100 ul x 3 adım).
7. Not: (biyotine konjüge edilmiştir), ikincil antikor yapıldığı aynı türden kullanımlar serumu.
8. Hafifçe çalkalama ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat süre ile tampon (100 ul / bölümü) engelleme bölümleri inkübe edilerek spesifik olmayan antikorun bağlanmasını önler.
9. Hafifçe çalkalama ile, gece boyunca 4 ° C 'de, bloke edici tampon içinde seyreltilmiş primer Ab (pERK) bölümleri inkübe edin.
10. Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın.
11. Hafifçe çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat için (adım 4.6 de kullanılan aynı) blokaj tamponunda seyreltilmiş: biyotin (250 1) ile konjüge edilmiş sekonder Ab kuluçkalayın.
12. Avidin ve biyotin kompleksi, oda sıcaklığında en az 30 dakika gerektirir, çünkü, aynı zamanda, ABC reaktifi hazırlayın.
13. Üreticilerin protokole göre ABC reaktifi gerekli hacmi hazırlayın.
14. Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın.
15. IncubatABC reaktifi ile oda sıcaklığında 45 dakika boyunca E bölümleri.
16. Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın.
17. DAB çözümü çalışma hazırlayın DAB karsinojenik ve teratojenik olduğu gibi, DAB içeren her adımda davlumbaz yapılmalıdır.
18. Plastik bir transfer pipet yeni bir plaka DAB çözüm aktarın.
19. Elle çözüm ve yavaş yavaş girdap plaka çalışma DAB içeren plaka yerleştirin bölümleri, bölümlere maksimum etkiyi sağlamak için.
20. Yeterli sinyal gelişene kadar mikroskop DAB reaksiyonu (2-5 dk) izleyin.
21. 0.1 M PBS (3 x 5 dk) doku yıkanarak istenen renk yoğunluğuna reaksiyonu durdurun.
22. Gecede davlumbaz kalan DAB substrat solüsyonu devre dışı bırakmak ve laboratuvar kurallarına göre onu imha etmek için çamaşır suyu kullanın.
23. Jelatin Mount bölümler PBS yüzen slaytlar kaplı. Sonra oda sıcaklığı en az 3-4 saat sonra kurutun.
24. % 50 kısımları, kurutmak,% 70,% 95% 100 2 dakika her biri için etanol ve 5 dakika için% 100 ksilen açık ve.
25. Montaj orta kullanarak lamel ve gece boyunca kurumaya davlumbaz bırakın.

5. Hücre Sayısı

1. Sayım pERK-pozitif hücreler, dorsal hipokamp seviyesinde 3-5 bölümler hayvan başına analiz edilmelidir.
2. Uygun bir mikroskop kullanılarak 200X büyütmede her bölüm birden fazla parlak alan görüntüler elde, ve daha sonra bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bunları bir araya.
3. ImageJ özgür yazılım kullanarak tiff-dönüştürülmüş mozaik görüntülerde hücre sayımı gerçekleştirin.
4. 100 × 100 um her 2-3 sayma kutuları üzerinde hilus ve granül hücre tabakasında pERK lekeli hücreleri saymak.
5. Hücre yoğunlukları sayma penceresi (100 x 100 um) ortalama işaretli hücrelerin sayısı olarak ifade edilecektir.
6. Genotipleri arasında anlamlı farklılık değerlendirmek için istatistiksel analiz gerçekleştirin. Bu Öğrenci t yapılabilirTest veya ANOVA ticari yazılımları kullanarak uygun post hoc testi ile izledi. P <0.05 Set istatistiksel anlamlılık düzeyi.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol imünohistokimya ile, görselleştirmek için tasarlanmıştır, nöro bozuklukların bir fare modelinde MWM sonra hipokampal nöron aktivitesi belirli bir markör ifade. Burada gösterilen tüm deneysel veriler bizim son işten ⁷ alınmıştır. Erkek ve kadın WT ve En2 ^{- / -} (3-5 aylık; ağırlık = 25-35 gr) yaştaki erişkin litermatlarının heterozigot çiftleşmelerin elde kullanılmıştır. Yirmi iki fareleri (genotip için 11) MWM kullanılmıştır. Sekiz fa...

Tartışmalar

^{/ - -} Fareler, nörogelişimsel bozuklukların fare modelini Burada, biz nöronal en2 içinde MWm aşağıdaki aktivasyon ifşa ettiği için bir pERK immünhistokimya protokol sağlar. ^{/ - -} PERK düzeylerinin azalması en2 CA3 subfield tespit edilmiştir mutantlar WT ile karşılaştırıldığında. Farklı CA3 alt alanına, pERK pozitif nöronlarının genel bir artış gözlenen ne yerine iki hilus saptanmış ve EN2 bölgesinin GCL ^{- / -} fareler WT ile karşılaştırıldığında....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
EthoVision XT 8	Noldus Information Technology		This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint	Giotto - Fila Group Company		White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome	Leica	VT1200	Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.
Sodium Azide	Sigma	S2002
PBS	Sigma	P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100	Sigma	T-8787
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normal Goat Serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100	Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope	Zeiss	Axio Imager.M2	Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA		To assemble images.
Image J software	National Institute of Health		Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0	Systat Software Inc. (USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6	GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.