Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Riepilogo

Descriviamo un protocollo immunoistochimica per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo seguito dell'esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. Questo protocollo può essere applicato a entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.

Abstract

Induzione di fosforilata chinasi extracellulare regolate (pERK) è una lettura molecolare affidabile di apprendimento-dipendenti attivazione neuronale. Qui, descriviamo un protocollo immunoistochimica pERK per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo seguito dell'esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. In particolare, abbiamo utilizzato immunostaining pERK studiare attivazione neuronale seguente Morris water maze (MWM, un compito di apprendimento classica ippocampo-dipendente) in engrailed-2 knockout (En2 ^{- / -)} topo, un modello di disturbi dello spettro autistico (ASD). Rispetto al wild-type (WT) controlli, En2 ^{- / -} topi hanno mostrato significativi deficit di apprendimento spaziale nel MWM. Dopo MWM, differenze significative nel numero di neuroni pERK-positivi sono stati rilevati in specifiche sottocampi dell'ippocampo di En2 ^{- / -} mice, rispetto agli animali WT. Così, il nostro protocollo può robustamente rilevare le differenze dineuroni pERK positivi associati alla compromissione apprendimento ippocampo-dipendente in un modello murino di ASD. Più in generale, il nostro protocollo può essere applicato per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo in entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.

Introduzione

Disturbi dello sviluppo neurologico sono un gruppo di disturbi come la sindrome di Down, la sindrome X fragile (FXS), la sindrome di Rett, neurofibromatosi, sclerosi tuberosa e ASD, in cui lo sviluppo e la maturazione del sistema nervoso centrale (SNC) è disturbato nella fase iniziale un'ampia ed eterogenea il periodo prenatale ^1. Queste disfunzioni dello sviluppo cerebrale possono causare profondi effetti per tutta la vita sulla funzione motoria, il linguaggio, l'apprendimento e il processo della memoria. Una pletora di fattori genetici e ambientali sono stati implicati nella patogenesi di disordini dello sviluppo neurologico negli ultimi anni ^2,3. Anche se i meccanismi molecolari alla base del fenotipo clinico rimangono sconosciute, i risultati di cui sopra hanno permesso lo sviluppo di diversi modelli murini di questi disturbi. Apprendimento e memoria deficit sono stati identificati in un certo numero di questi modelli di topo, come Tsc1 ^+/-, TSC2 ^+/-,Nf1 ^+/- e En2 ^{- / -} mice ^2,4-7. Una sfida importante nel campo dei disturbi del neurosviluppo è l'identificazione dei processi cellulari e molecolari alla base della memoria e dell'apprendimento erettile. Vie di segnalazione selezionati attivate durante l'apprendimento o la memoria possono indurre la trascrizione di geni specifici e alla fine porterà a de novo sintesi proteica. Geni immediati-precoce (IEGs) attivazione e proteine-dipendente modifiche sinaptiche stanno rapidamente indotte in neuroni del cervello in risposta all'attività neuronale e formazione comportamentale ^8,9.

Deficit di vie di segnalazione che coinvolgono neurofibromin sono stati associati con l'apprendimento compromessa in disturbi dello sviluppo neurologico. Neurofibromin è il prodotto del gene NF1, cui mutazione provoca neurofibromatosi tipo 1, una sindrome genetica complessa caratterizzata da tumori del sistema nervoso, ritardi comportamentali e motorie e cognitive disabilità ^10. Eterozigoti Mice per Nf1 cancellazione limitata ai neuroni inibitori mostrano deficit nella prima fase di potenziamento a lungo termine (LTP), così come l'apprendimento spaziale compromessa MWM ^5,11,12. È interessante notare che la carenza Nf1 in questo modello di topo porta ad una attivazione eccessiva di segnalazione Ras in interneuroni inibitori durante l'apprendimento, con conseguente aumento della fosforilazione ERK ed infine in un miglioramento anormale di rilascio di GABA da questi neuroni ^5.

Sulla base di questi risultati, la visualizzazione dell'attività neuronale dopo compiti comportamentali rappresenta un modo per ricostruire i circuiti specifici coinvolti in malattie dello sviluppo neurologico. Il protocollo immunoistochimica qui descritta ha lo scopo di valutare e quantificare dell'ippocampo livelli di fosforilazione ERK seguenti MWM in un modello di topo con ASD deficit cognitivi. MWM è ampiamente utilizzato per studiare dipendente apprendimento spaziale dell'ippocampo e la memoria nei roditori ^13,14 . Decidiamo di utilizzare ERK fosforilazione come lettura molecolare di apprendimento ippocampo compito-dipendente, dal momento che ERK ha dimostrato di avere un ruolo essenziale nell'apprendimento e nella memoria la formazione ^15. Inoltre, il percorso ERK è necessaria per la plasticità esperienza-dipendente in via di sviluppo corteccia visiva ^16. Infine, topi privi di uno dei due isoforme (ERK ERK2) in mostra CNS contrassegnati anomalie nei comportamenti cognitivi, emotivi e sociali ^17, che indica che la segnalazione ERK potrebbe giocare un ruolo fondamentale nella patogenesi di disturbi dello sviluppo neurologico, come ASD.

Abbiamo usato engrailed 2 knockout (En2 ^{- / -)} topo come modello di disturbi dello sviluppo neurologico. En2 ^{- / -} topi mostrano le caratteristiche anatomiche e comportamentali "ASD-like", tra cui la perdita di interneuroni prosencefalo ^18, ridotta espressione di geni ASD-correlati ^19, diminuzione socialità, e la flessibilità cognitiva ^6,7,20. Learni spazialeng e difetti di memoria, come quelli rilevati in MWM, sono particolarmente robusti in En2 ^{- / -} mice ^6,7 e potrebbero essere rilevanti per i deficit cognitivi osservati nei pazienti ASD ^21. Inoltre, abbiamo dimostrato che alterata apprendimento spaziale in MWM è associata con l'espressione neurofibromin ridotti e aumento dei livelli di Perk nel ilo di En2 ^{- / -} topi adulti ^7. Qui vi presentiamo il protocollo dettagliato per la caratterizzazione immunoistochimica di pERK seguito MWM in questo modello di topo ASD.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Direttiva della Comunità Europea 2010/63 / UE e sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano.

1. Animal Care, Housing e trattamento

1. Eseguire tutti i protocolli sperimentali utilizzando topi in conformità con le linee guida del rispettivo cura degli animali istituzionale.
2. Mantenere gli animali in una 12 ore di luce / buio ciclo con cibo e acqua ad libitum.
3. Casa i topi in gruppi di 2-4, in gabbie topo policarbonato di dimensioni standard con segatura e una lettiera con cambio settimanale.
4. Utilizzare l'età e topi di sesso-matched, perché la suscettibilità alla malattia può variare con l'età e genere in diversi modelli murini di disturbi dello sviluppo neurologico.
5. Scegliere un numero adeguato di animali per raggiungere la significatività statistica (un minimo di 10 topi per genotipo per lo studio comportamentale e 4 topi per genotipo per l'esperimento immunoistochimica).

2. Morris Water Maze (MWM)

1. Utilizzare una circolare Tank (diametro 100 cm, altezza 50 cm).
   1. Mettere alcuni suggerimenti visivi sui divisori intorno al serbatoio.
   2. Posizionare una piattaforma di 10 cm di diametro nel serbatoio in posizione fissa nel centro di uno dei quattro quadranti immaginari. Tenere la piattaforma nascosta nello stesso quadrante per tutte le prove in tutti i corsi di formazione.
   3. Riempire la piscina con acqua di rubinetto fino a quando la piattaforma è di 1 cm al di sopra della superficie dell'acqua. La temperatura dell'acqua Equilibrare dovrebbe essere vicino ai 22 ° C; questa operazione può richiedere diverse ore. Aggiungere acqua calda per abbreviare il tempo necessario per equilibrare la temperatura dell'acqua.
   4. Aggiungere circa 1,5-2 L di bianco, vernice atossica per rendere l'acqua opaca.
2. Traccia Acquisizione Procedura
   1. Impostare sistema di tracciamento di MWM con telecamere CCD standard e schede video. Scegli un sistema di video-tracking per monitorare e analizzare diverse variabili, quali la lunghezza del percorso, escala latenza pe, e il tempo trascorso in ogni quadrante.
   2. Dividete l'arena in quattro quadranti e regolare le impostazioni di rilevamento per assicurare il massimo contrasto tra gli animali e lo sfondo per il monitoraggio in tempo reale.
   3. Specificare la regione piattaforma.
   4. Impostare il tempo massimo di processo come 60 sec.
3. MWM Testing
   1. Prima della prova comportamento, consentire topi un periodo di adattamento di 20-25 minuti in una zona dove non possono vedere la piscina o indizi spaziali.
   2. Treno ogni mouse per 9 giorni (due prove consecutive al giorno, con 20-30 minuti intervallo tra loro).
   3. Accendere il computer e la macchina fotografica e avviare il software di sistema di video-tracciamento.
   4. Prendere il mouse per la coda e metterlo in acqua, con la testa rivolta verso il lato della piscina, a partire da una delle quattro posizioni di partenza (nord, sud, est, ovest). Per ogni mouse, la posizione di partenza dovrebbe essere diverso e pseudorandomized in tutti gli studi.
   5. Lasciate che la nuotata del mouse e cercare il piattafORM per un massimo di 60 secondi. Una volta che l'animale raggiunge la piattaforma, consentono di rimanere sulla piattaforma per 20 sec.
   6. Se il mouse non è riuscito a individuare la piattaforma entro quel tempo, guidare delicatamente il mouse per la piattaforma, tenendolo per la coda e lasciarlo a rimanere lì per 20 sec. Una volta che l'animale ha completato tutte le due prove, asciugarlo con un panno e rimetterlo in gabbia.
   7. Ogni giorno del periodo di formazione, ripetere la stessa procedura (punti 2.3.4-2.3.6).
   8. Eseguire il test della sonda il giorno 9 dopo l'ultima traccia di formazione.
   9. Rimuovere la piattaforma dalla piscina.
   10. Lasciate che la nuotata del mouse e cercare la piattaforma per un massimo di 60 secondi.
   11. Periodicamente, controllare la temperatura dell'acqua in modo che dovrebbe essere la stessa (22 ° C) e pulire la piscina.

3. Preparazione delle sezioni di perfuso Animali

1. Sacrifica i topi alla fine di MWM. Quattro topi per genotipo devono essere anestetizzati prima euthanizzione secondo le linee guida locali e internazionali.
2. Profumato l'animale transcardially (tagliare destra auriclewith una forbice per consentire lo sfiato e introdurre una cannula farfalla nel ventricolo sinistro di perfusione) con tampone fosfato (PBS) per 4-5 minuti, seguiti da 4% paraformaldeide in PBS per 10-15 min ^22.
3. Sezionare e post-fix cervelli in paraformaldeide 4% a 4 ° C per almeno 12 ore.
4. Mettere il cervello in 50 ml provette in polistirene coniche contenente 15 ml di 0,02% di sodio azide a 0,1 M PBS e conservare a 4 ° C fino al momento per affettare.
5. Tagliare e rimuovere il cervelletto prima vibratome taglio.
6. Incollare il cervello in posizione verticale con il sito di taglio, utilizzando colla, sulla piastra di supporto del vibratome.
7. Tagliare il cervello in 20-40 micron di spessore sezioni coronali, in ordine seriale durante l'ippocampo dorsale, su appositi vibratome.
8. Raccogliere vibratome fette con un pennello e trasferirli in un 24 piastra multi-pozzetti contenenti 1 ml di 0,1 M PBS per ogni pozzetto.
9. Conservare sezioni per breve termine in PBS o lungo termine a 0,02% di sodio azide in PBS a 4 ° C (tessuto potrebbero essere utilizzati per un massimo di un anno).

4. immunoistochimica

1. Trasferimento 3-5 dorsali sezioni di ippocampo per ogni mouse, in 24 piatto multi-pozzetti contenenti 500 ml di 0,1 M PBS per ogni bene.
2. Lavare le sezioni contenute in ogni pozzetto con 500 ml di 0,1 M PBS (5 min, 3 volte con agitando delicatamente).
3. Quench attività perossidasica endogena, incubando le sezioni in 1% H ₂ O ₂ in PBS per 20 minuti con agitazione.
4. Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min).
5. Permeabilizzazione di tessuto: incubare sezioni per 5 min in 0,2% Triton X-100 in PBS.
6. Durante le fasi di cui sopra (4.4, 4.5), fare tampone di bloccaggio abbastanza (10% capra siero e 0,1% Triton-X100 in PBS) per l'intero esperimento (number delle sezioni x 100 ml x 3 gradini).
7. Nota: Utilizzare siero dalle stesse specie in cui è stata fatta la Ab secondario (coniugato con biotina).
8. Impedire legame non specifico dell'anticorpo, incubando le sezioni in tampone di bloccaggio (100 microlitri / sezione) per 1 ora a temperatura ambiente (RT) con agitazione.
9. Incubare sezioni nel primario Ab (pERK) diluito in tampone di bloccaggio, notte a 4 ° C, con agitazione.
10. Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min).
11. Incubare con l'anticorpo secondario coniugato con biotina (1: 250) diluito in tampone di bloccaggio (stesso usato nella fase 4.6) per 1 ora a RT con agitazione.
12. Preparare reagente ABC allo stesso tempo, perché avidina e biotina richiedono almeno 30 minuti a temperatura ambiente al complesso.
13. Preparare il volume richiesto di reagente ABC in base al protocollo costruttori.
14. Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min).
15. Incubate sezioni per 45 minuti a temperatura ambiente con ABC reagente.
16. Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min).
17. Preparare DAB soluzione di lavoro, ogni passo che coinvolge DAB deve essere fatto nella cappa come DAB è cancerogeno e teratogeno.
18. Trasferire soluzione DAB per una nuova piastra con una pipetta di plastica trasferimento.
19. Posizionare sezioni nel piatto contenente DAB soluzione e piastra lentamente ricciolo di lavoro a mano, per consentire la massima esposizione alle sezioni.
20. Monitorare reazione DAB sul microscopio fino segnale adeguato sviluppa (2-5 min).
21. Arrestare la reazione all'intensità colore desiderato lavando il tessuto in 0.1 M PBS (3 x 5 min).
22. Utilizzare candeggina per disattivare qualsiasi residuo soluzione di substrato DAB nella cappa durante la notte e smaltirlo secondo le linee guida del laboratorio.
23. Sezioni Montare su gelatina rivestite diapositive da galleggianti in PBS. Poi asciugare a temperatura ambiente di almeno 3-4 ore.
24. Disidratare il sezioni sequenzialmente nel 50%, 70%, 95%e 100% etanolo per 2 minuti ciascuna, e chiaro in 100% xilene per 5 min.
25. Coverslip con mezzo di montaggio e lasciare in cappa asciugare per una notte.

Conte 5. cellulare

1. Contare le cellule pERK-positivi, da tre a cinque sezioni a livello dell'ippocampo dorsale devono essere analizzati per animale.
2. Acquisire più immagini in campo chiaro da ogni sezione a 200 ingrandimenti utilizzando un microscopio adeguato, e poi montarli utilizzando un software di elaborazione delle immagini.
3. Eseguire la conta delle cellule sulle immagini a mosaico tiff convertiti utilizzando il software gratuito ImageJ.
4. Contare le celle pERK macchiato nello strato di cellule ilo e granuli sopra 2-3 conteggio scatole da 100 × 100 micron ciascuna.
5. Densità cellulari saranno espressi come numero di cellule marcate per intervallo di conteggio (100 × 100 micron).
6. Eseguire l'analisi statistica per valutare significative differenze tra genotipi. Questo può essere realizzato con t di Studenttest o ANOVA seguita da test post hoc appropriato utilizzando software commerciali. Impostare il livello di significatività statistica p <0.05.

Risultati

Il protocollo qui descritto è stato progettato per visualizzare, mediante immunoistochimica, l'espressione di un marcatore specifico di attività dei neuroni dell'ippocampo dopo MWM in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico. Tutti i dati sperimentali riportati nel presente documento sono state prese dal nostro lavoro recente ^7. Sono stati utilizzati ottenuti da accoppiamenti eterozigoti, fratellini di pari età adulta (peso = 25-35 g 3-5 mesi di età) ^- maschio e femmina ...

Discussione

Qui, mettiamo a disposizione un protocollo immunoistochimica pERK per aver rivelato l'attivazione neuronale seguente MWM in En2 ^{- / -} mice, un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico. Livelli di pERK Diminuzione sono stati rilevati nel sottocampo CA3 di En2 ^{- / -} mutanti rispetto ai WT. A differenza di quanto osservato in CA3 sottocampo, un aumento generale dei neuroni pERK-positivi è stata invece rilevata sia ilo e GCL di En2 ^{- / -} mice rispetto al WT. Una possibile s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
EthoVision XT 8	Noldus Information Technology		This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint	Giotto - Fila Group Company		White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome	Leica	VT1200	Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.
Sodium Azide	Sigma	S2002
PBS	Sigma	P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100	Sigma	T-8787
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normal Goat Serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100	Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope	Zeiss	Axio Imager.M2	Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA		To assemble images.
Image J software	National Institute of Health		Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0	Systat Software Inc. (USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6	GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.