JoVE Logo
Faculty Resource Center

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Neuroscience

Анализ Разработка зуб Микроб иннервации Использование Микрожидкостных Сотрудничество культуры устройств

Published: August 14th, 2015

DOI:

10.3791/53114

1Institute of Oral Biology, Unit of Orofacial Development and Regeneration, University of Zurich

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Иннервация играет ключевую роль в разработке, гомеостаза и регенерации органов и тканей. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе этих явлений не хорошо, но понял. В частности, роль в развитии иннервации зубов и регенерации пренебречь.

Несколько в естественных исследований получены важные сведения о закономерностях иннервации тканей зубов во время развития и ремонтных процессов различных животных моделях. Тем не менее, большинство из этих подходов не являются оптимальными для выделения молекулярную основу взаимодействий между нервными волокнами и контрольных органов и тканей.

Co-культуры представляют собой ценный метод для исследования и манипулирования взаимодействия между нервными волокнами и зубов в контролируемой и изолированной среде. В последние десятилетия, обычные совместных культурах, используя тот же культуральную среду были проведены в течение очень коротких периодов (например, два дня)исследовать привлекательные или отталкивающие эффекты развивающихся устные и зубные ткани на сенсорных нервных волокон. Тем не менее, продление срока культуры, необходимых для расследования последствий иннервации на зуб морфогенеза и дифференцировки клеток.

Microfluidics системы позволяют совместное культивирование нейронов и различных типов клеток в их соответствующей культуральной среде. Недавно мы показали, что тройничного ганглиев (ТГ) и зубы способны выживать в течение длительного периода времени при совместном культивировании в микрожидкостных устройств, и что они поддерживают в этих условиях тот же шаблон иннервации, что они показывают в естественных условиях.

На этой основе, мы опишем, как изолировать и совместное культивирование развития тройничного ганглиев и зубные бактерии в протоколе микрофлюидных сокультуры system.This описывает простой и гибкий способ совместного культивирования ганглиев / нервы и ткани-мишени и изучать роли специфических молекул на таких взаимодействий в Controlled и изолированная среда.

Иннервация играет ключевую роль в разработке, гомеостаза и регенерации органов и тканей 1,2. Кроме того, иннервации участвует в регуляции пролиферации стволовых клеток, мобилизации и дифференциации 3 - 5. Действительно, недавние исследования, реализованные в тканях орофациального комплекса показали, что парасимпатических нервов являются необходимыми для функции эпителия клеток-предшественников во время развития и регенерации слюнных желез 6,7. Точно так же было показано, что иннервация необходимо для развития и поддержания вкусовых рецепторов 8 - 11. Таким образом, важно, чтобы проанализировать еще пренебрегают роли иннерва....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все мыши были сохранены и обработаны в соответствии с Законом швейцарской защиты животных и в соответствии с правилами офисе Кантональная ветеринарной, Цюрих.

1. Подготовка вскрытия Материал, медиакультуры, микрофлюидных устройств

  1. Автоклав микро-рассечение пинц?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Эти результаты показывают, что изолированные тройничного ганглиев может расти в одном отсеке микрожидкостных устройств и, кроме того, что развитие изолированных зубных зачатков выдержан в течение длительного периода времени в другой отсек микрожидкостных устройств. Различные питат?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Предыдущая в пробирке исследования зубной иннервации были основаны на обычных сокультурах тройничного ганглиев и зубных тканей или клеток 26,28,29. Эти исследования были проведены, чтобы исследовать в основном привлекательные эффекты этих клеток или тканей на сенсорных аксон.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
AXIS Axon Isolation DevicesMilliporeAX15010-TCMicrochannels of different lenght are available
LamininSigma AldrichL2020
NeurobasalGibco21103-049
B27Gibco17504
Recombinant Mouse beta-NGFR&D Systems1156-NG-100Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12Gibco11320-033

  1. Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
  2. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
  3. Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
  4. Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
  5. Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
  6. Knox, S. M., Lombaert, I. M. a., Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
  7. Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
  8. Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
  9. Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
  10. Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
  11. Mistretta, C. M., Goosens, K. a., Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
  12. Mitsiadis, T. a., Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
  13. Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
  14. Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
  15. Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
  16. Mitsiadis, T. a., Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
  17. Mitsiadis, T. a., Luukko, K. Neurotrophins in odontogenesis. The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).
  18. Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
  19. Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
  20. Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
  21. Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  22. Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
  23. Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
  24. Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
  25. Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
  26. Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
  27. Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
  28. Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
  29. Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
  30. Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
  31. Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. Odontogenesis. Methods in Molecular Biology. 887, (2012).
  32. Mitsiadis, T. a., Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
  33. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
  34. Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
  35. Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
  36. Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
  37. Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
  38. Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved