Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
的RNA介导的击倒被广泛用于控制基因表达。该技术多功能系列采用可与任何序列合成和设计,以配合针对任何沉默基因的短RNA(斯尔纳)的。因为的sRNA构建可以引入到许多细胞类型直接或使用各种载体,基因表达可以在活细胞中,而不费力遗传修饰被抑制。最常见的RNA拦截技术,RNA干扰(RNAi),利用了靶mRNA的内源RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的序列识别和切割的。因此这种技术的应用只限于RISC的表达生物体,主要是真核生物。近日,新一代生物技术RNA已经开发的替代机制,通过RNA调控基因表达,在细菌,因此成为可能RNA介导的基因击倒。在这里,我们介绍了一种沉默基因EXPRES锡永在E.大肠杆菌的功能类似于RNA干扰。在这个系统中的合成噬菌粒被设计来表达的sRNA,其可设计为靶向任何序列。表达构建体递送到大肠杆菌的群体的大肠杆菌细胞与非裂解M13噬菌体,在这之后能够稳定地复制作为质粒。反义识别与靶mRNA的沉默由HFQ蛋白质,内源性大肠杆菌介大肠杆菌 。该协议包括用于设计反义的sRNA,构建噬菌粒载体,包装噬菌粒到M13噬菌体,感染制备活细胞群体,并执行感染本身的方法。荧光蛋白mKate2和抗生素抗性基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)定位到产生代表数据和量化击倒效力。
的RNA介导的基因击倒进行两个阶段。首先,将RNA分子引入到细胞系或研究的有机体。第二,内源性RNA结合蛋白促进RNA的目标识别和产生的消声效果。所有的RNA拦截技术受益于合成sRNAs的定制性质,可以容易地制造,以匹配感兴趣的特定目标。然而,RNA摄取和沉默的分子细节横跨模型系统广泛地变化,限制在哪里以及如何的RNA击倒可以应用。
在线虫,双链RNA(dsRNA)的分子可直接在介质或通过用双链RNA表达大肠杆菌的群体喂食蠕虫引入大肠杆菌细胞1,2-,在果蝇中 ,RNA干扰,可以通过用双链RNA 3显微注射的胚胎通过简单地添加的dsRNA至培养基4来实现,或在细胞系中实施。在哺乳动物细胞系,合成小干扰RNA(siRNA)可以通过电穿孔1,2,5递送到活细胞,封装在脂质体3,6,或从DNA质粒载体4,7-表达。一旦RNA种类到达胞质溶胶,RNAi途径依赖于RISC复合物处理的ds RNA,促进靶的反义识别,并催化翻译抑制,mRNA降解,或异染色质形成,这取决于主机上。
由于这些要求的,古典的RNAi只能在有效地吸收外源RNA并表达RISC或类RISC活性有机体进行。值得注意的是,这不包括模型细菌E.大肠杆菌 ,它缺乏RNAi途径。然而,最近在合成生物学的发展提供必要的工具来解决这两个问题,交付和沉默问题。
在这个协议中,斯尔纳构建在大肠杆菌表达来自大肠杆菌的DNA载体交付给李咏使用M13噬菌体/辅助系统细胞。噬菌粒是复制的噬菌体衍生的F1起源的质粒。辅助质粒,在此情况下M13KO,进行所有以产生病毒颗粒所要求的机械,但本身不是胜任复制和包装。当噬菌粒和辅助质粒被共转化,单独噬菌粒是在F1原点复制,包装和分泌的。该矢量噬菌体是那么能干感染现场E.通过F菌毛的大肠杆菌 。
在这个系统中,沉默效应是由定制的sRNA盒结合的靶结合序列的支架序列产生。靶结合序列是反义的mRNA靶24个碱基对,通常是在核糖体结合位点(RBS)。该支架序列,由娜和他的同事开发出8,包含MICC,小调控RNA内源性大肠杆菌提取的HFQ结合基序大肠杆菌 。该HFQ蛋白刺激RNA的RNA结合蛋白g且mRNA降解,供应在该系统类似于RISC中的RNAi作用。 图1描绘了用于噬菌体介导的sRNA击倒,包括的sRNA盒结构,噬菌粒矢量,和消音机构的完整方案。
作为一种方法来调节在大肠杆菌中基因表达的大肠杆菌 ,斯尔纳沉默是简单,快速和灵活。有针对性的E.大肠杆菌是不是负担超出传播噬菌粒表达斯尔纳。这可能是在合成生物学或基础研究,其中较大的异源构建体的表达可以应变蜂窝资源9的上下文相关的。与新的目标噬菌粒可以用单个的PCR来制备和噬菌粒转化后收获一天。最后,几乎所有的表达可以有针对性。所述的sRNA调节盒(在标准的质粒)已经显示出对各种目标在代谢与典型的压制水平> 90%8工作。
10先前的工作扩展。首先,一个包装噬菌粒引入到大肠杆菌的分批培养大肠杆菌细胞并用于沉默荧光蛋白mKate2的表达。后续的荧光变化进行实时监测。第二,撞倒CAT基因中示出减少在琼脂平板上的表型氯霉素抗性。在这两种情况下,噬菌粒本身携带GFP标记,允许待测量独立的击倒效率感染率。
1.设计轴承斯尔纳沉默盒噬菌粒载体的构建
M13包装库存噬菌粒2.生产和收获
3. F +靶细胞的制备沉默
4.感染了沉默噬菌粒包装
在液体介质mKate2荧光沉默
图1描绘了用于在这项工作中所描述的sRNA介导的击倒,包括的sRNA盒设计,噬菌粒矢量,和沉默机制的方案。以下协议1.2,质粒pAB.001的斯尔纳沉默盒改变目标mKate。该斯尔纳盒原料合成并克隆到噬菌粒Litmus28i_J23115-B0032-GFP,莫妮卡奥尔蒂斯和德鲁恩迪11的礼物。此噬菌粒携带GFP表达和卡那霉素抗性标记,允许被跟踪成功感染。制备包装噬菌股以下协议2。
E.的衍生物大肠杆菌 K12 MG1655背着一个组成型表达,染色体整合mKate2标记是由共轭的噬菌体感染准备用以下方案3细胞生长至对数中期,介绍以下协议4.噬菌粒感染后噬菌粒一个F质粒供体菌株,200微升的培养物转移到荧光板读数器和荧光24小时连续监测。
图3示出的sRNA介导的沉默对mKate2表达的影响。感染与抗mKate2噬菌粒的菌株没有表现出可检测的mKate2荧光超过本底。相比之下,这株没有表达GFP标记,表明噬菌体的成功吸收。未感染的对照细胞产生mKate2荧光但不GFP。附加控制,其中,反mKate2靶向域与一个序列靶向的CAT取代,对mKate2荧光没有影响。
氯霉素抗性的琼脂平板上沉默
内容“FO:保together.within页=”1“>以下协议1.1,制作一个斯尔纳沉默卡带目标CAT 大肠杆菌 K12 MG1655背着一个组成型表达,染色体整合CAT标志是为准备的衍生物。噬菌体感染通过与以下方案3.将细胞在F-质粒供体菌株偶联生长到对数中期和噬菌粒在37℃下引入以下协议4.温育1小时后,感染的细胞进行系列稀释,并在镀的氯霉素浓度。将板范围温育过夜,并抗性细胞中的每一个氯霉素浓度的比例通过计数菌落形成单位(CFU的)次日确定。图4示出的sRNA介导的沉默对氯霉素抗性的表型的影响。未感染的细胞,或感染噬菌粒靶向mKate2细胞,分别以抗氯霉素在所有测试浓度。相比之下,感染了针对噬菌粒细胞CAT在低浓度氯霉素减少显示出生存,近99%的较高浓度杀。添加氨苄青霉素,要选择只携带细菌噬菌体,减少氯霉素生存检测不到的水平。这与早期的工作一致表示从噬菌体感染的逃避逃跑沉默10共同路线。
图1:在 大肠杆菌 的基因沉默 大肠杆菌 用的sRNA表达盒由M13噬菌体递送的的sRNA盒是由4个模块:所述PR启动子(来自λ噬菌体来源的组成型启动子),一个24bp的靶向结构域,HFQ结合域从MICC提取和转录终止子8 大肠杆菌大肠杆菌表达在F菌毛,其中斯尔纳表达开始。该斯尔纳然后招募HFQ蛋白(红色表示),并结合反义靶mRNA核糖体结合位点附近,导致翻译抑制和mRNA降解。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2:引物的设计和的sRNA目标站点的定点诱变的引物被设计具有部分同源性的现有的sRNA盒。正向引物含有20bp的同源的5'端的PR启动子,接着表示新的指南序列24碱基,然后18碱基对同源的3'末端的HFQ结合结构域。反向引物是正向引物的确切反向互补,与现有的sRNA盒侧翼的新指南序列的反向互补同源性的区域。确切的引物序列在表3中给出。与正向和反向引物的独立的单引物的PCR反应产生具有所需修饰的序列的直链,单链DNA。退火正向和反向的反应产物,按照如在协议中所述的清理,结果在双链DNA质粒带有所需修改斯尔纳磁带。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3:K一个染色体整合mKate2荧光记者nockdown。E.大肠杆菌 MG1655 K12表达mKate2要么感染与抗mKate2噬菌粒(绿线和棒)左未处理(红色线和条),或感染了控制噬菌粒靶向CAT(蓝线和条)。 ( 一 )未经处理的E.大肠杆菌上升到更高的饱和密度,说明代谢成本噬菌体感染。虚线表示的3次重复的标准偏差。 (B)中的mKate2信号降低到接近背景水平在抗mKate2处理应变,而不是在对照菌株。 (C)GFP荧光,也由噬菌粒携带,只在噬菌粒处理的对照是可检测的。 (D,E)最终荧光读数生长24小时后标准化为外径。 GFP信号,指示噬菌体感染时,在未经处理的控制缺席,而且还大幅减少以下抗猫phagemid治疗。这可以指示噬菌粒的脱靶效应。所述mKate2信号减少了抗mKate2噬菌粒治疗相比未处理的对照。在CAT-针对性的控制噬菌显示对mKate2荧光没有影响。误差棒代表3次重复的标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4:CAT的击倒恢复氯霉素敏感性遗传抗性种群E.。 大肠杆菌 MG1655 K12表达染色体整合CAT基因不进行处理(红色条),用控制噬菌粒靶向mKate2(绿色柱)处理,或用表达抗CAT的sRNA(蓝色条)噬菌粒处理。 1小时后感染,生存能力上表示蚂蚁ibiotics被连续稀释和电镀评估。用抗CAT噬菌粒处理过的菌株通过在较高浓度氯霉素显著杀死(> 90%),而对照处理不受影响。加入氨苄青霉素到培养板正选择用于噬菌粒感染和消除未感染的细胞。在这些条件下,抗CAT处理后没有观察到氯霉素抗性菌落。这表明大多数幸存者代表感染的故障,而不是沉默的故障。误差棒代表3次重复的标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。
CAT靶序列 | 5' - ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3' |
CAT指导序列 | 5' - ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3' |
表1:示例TARGET和指导序列的CAT基因注意的反向互补关系。
PR启动 | TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC | ||||
指导序列 | ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT | ||||
HFQ结合域 | TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG | ||||
T1 / TE终结者 | CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA |
表2:所述的sRNA盒式序列组件每个序列写入5'-3'。完整的磁带是这4个元素的串联,以便与包括BP 292。
正向引物 | 5' - CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3' |
反向引物 | 5' - GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3' |
表3:引物的设计改变现有引导元件的正向引物包括在过去的20碱基对的PR启动子,新的指导序列,和HFQ结合结构域的前18个碱基对。靶序列是指导序列的确切反向互补。反向引物是正向引物的确切反向互补。
表4:推荐条件的单引物诱变的PCR。
步 | 温度 | 时间 |
初始变性 | 98℃ | 30秒 |
30个循环 | 98℃ | 10秒 |
55°C | 30秒 | |
72℃ | 120秒 | |
最终延伸 | 72℃ | 300秒 |
存储 | 10℃ |
表5:推荐热循环协议的单引物诱变的PCR。
零件 | 卷 |
模板DNA | 1微升 |
10μM正向引物 | 0.5微升 |
10μM反向引物 | 0.5微升 |
Taq酶2X预混 | 25微升 |
无核酸酶的水:- [R | 23微升 |
总成交量 | 50微升 |
表6:建议的条件为序列验证PCR。
步 | 温度 | 时间 |
初始变性 | 95℃ | 30秒 |
30个循环 | 95℃ | 30秒 |
55°C | 30秒 | |
68℃ | 30秒 | |
最终延伸 | 68℃ | 300秒 |
存储 | 10℃ |
表7:建议热循环仪专业版母育的序列验证PCR。
相比于不相关的对照本方法实现了mKate荧光水平减少80%。这是符合其他RNA敲除的方法,其中完整的沉默不遵守和50-90%的效率是典型的16,17。在表型水平,CAT定位击倒能够显著衰减氯霉素抗性,且消除它在某些条件下。
只有几个小时后感染( 图3B)后,击倒表型是在群体水平检测。这说明了基于噬菌体的输送的一个重要特征:高的击倒频率可以直接在分批培养无需事先遗传修饰而获得。不像使用质粒转化或基因组整合常规遗传修饰,噬菌体感染不要求一个人口从单个孤立菌落再生长。这使得噬菌体感染的效果是EXPLORED与复杂的空间动态11的人群,像生物膜18,或者在基因混合自然种群19预先存在的空间结构。
该方法的关键步骤是在高滴度的生产包装噬菌粒。与噬菌体颗粒的生产相关的代谢负担可能会导致在噬菌粒生产菌株的突变或质粒损失率高。建议在噬菌粒生产菌株从单个共转化菌落直接培养,不冷藏之前,噬菌体收获冷冻或子培养。引入噬菌粒和辅助质粒到大肠杆菌时,也可以观察到共转化的效率低同时大肠杆菌 。在这种情况下,更高的效率可以通过首先将所述辅助质粒,然后制备感受态细胞的轴承用于与噬菌粒随后转化辅助质粒而获得。
帕gemid感染或的sRNA表达还对靶细胞的可检测的代谢负担,并且可能导致一些表型扰动。例如,在mKate2荧光的减少观察到即使当细胞感染噬菌粒靶向CAT( 图3)。与M13感染是没有想到来触发E.全身应激反应大肠杆菌 20,但也可以间接地改变转录模式。另外,包括在噬菌粒的GFP或氨苄青霉素抗性标记可能会争夺资源的细胞,减少mKate2表达和9。最后,的sRNA盒本身可以全局通过滴定HFQ蛋白改变基因表达谱,或通过脱靶mRNA的沉默。脱靶效应在体内 RNA干扰21-23常见,但他们还没有被系统地研究了这个系统。
这种方法的一个限制是该感染艾菲效率低于100%,允许一些未感染的细菌中的人口持续。这项工作,并早期工作10的结果表明,未感染细胞代表最终人口的1-10%,并且负责大多数观察到的nonsilenced表型。各种路由M13-电阻是已知的,与菌毛表达24的最常见的突变损失。在这些限制的光,控制应该被用来确认高感染率和敲低效率。
在某些应用中另一个潜在的限制是污染辅助噬菌体偶尔传输。虽然M13K07包含突变的包装信号,它可以被包装成在低频噬菌体衣壳,并转移到受感染的人群中,导致胜任噬菌体生产和噬菌体超出了最初的感染事件25继续扩散的细胞。修改辅助噬菌体已被证明有效在以降低生产噬菌体26的成本降低了非特异性的包装,虽然有时。
改造噬菌体已成为大肠杆菌的必备工具大肠杆菌合成生物学,允许快速交货的新基因,以不断增长的人口。最近的工作已经产生细胞间通信电路11或表达的转录因子来抑制抗生素耐药性的途径27。这里介绍的协议增加了工具,允许通过编程的RNA细菌生理控制不断增长的集合。 CRISPR-CAS核酸酶,突变以消除核酸酶活性时,已经示出在RNA的引导基因靶17,28到抑制转录。与此相反,的sRNA沉默工作在翻译水平,并且不需要外源蛋白的表达。下一代生物技术可联合转录和翻译控制与噬菌体介导的递送到复杂苯氧编程类型的实时性。
The authors have nothing to disclose.
这项工作的经费由基金会贝当古舒莱尔支持贝当古巴黎队iGEM大赛提供。我们感谢INSERM U1001科研单位,尚塔尔对于LOTTON技术援助和咨询。噬菌体Litmus28i_J23115-B0032-GFP是由莫妮卡·奥尔蒂斯和斯坦福大学的德鲁恩迪提供。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |
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