Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
RNA-förmedlad knockdowns används ofta för att kontrollera genuttryck. Denna mångsidiga familj av tekniker använder kort RNA (sRNA) som kan syntetiseras med vilken som helst sekvens och utformats för att komplettera varje gen riktade för ljuddämpning. Eftersom sRNA-konstruktioner kan införas i många celltyper direkt eller med hjälp av en mängd olika vektorer, kan genuttryck undertryckas i levande celler utan mödosam genetisk modifiering. Den vanligaste RNA knockdown teknik, RNA-interferens (RNAi), använder sig av den endogena RNA-induced silencing complex (RISC) medla kvensigenkännande och spjälkning av mål-mRNA. Tillämpningar av denna teknik är därför begränsade till RISC-uttryckande organismer, främst eukaryoter. Nyligen har en ny generation av RNA biotekniker utvecklat alternativa mekanismer för att kontrollera genuttryck genom RNA, och så möjliggjort RNA-medierad gen knockdowns i bakterier. Här beskriver vi en metod för att tysta genen expressionen i E. coli som funktionellt liknar RNAi. I detta system en syntetisk fagemid är utformad för att uttrycka sRNA, vilket kan utformade för att rikta någon sekvens. Expressionskonstrukten levereras till en population av E. coli-celler med icke-lytisk M13-fag, varefter den är i stånd att stabilt replikera som en plasmid. Antisens erkännande och tystande av mål-mRNA förmedlas av Hfq protein, endogena för E. coli. Detta protokoll omfattar metoder för att utforma antisense sRNA, konstruktion fagemidvektorn, förpackning fagemiden i M13 bakteriofag, förbereder en levande cell population för infektion, och utför infektionen själv. Det fluorescerande proteinet mKate2 och antibiotikaresistensgenen kloramfenikolacetyltransferas (CAT) är riktade för att generera representativa data och för att kvantifiera knockdown effektivitet.
RNA-medierad gen knockdowns vidare i två etapper. För det första är en RNA-molekyl presenterad för en cellinje eller organism av studien. För det andra, endogena RNA-bindande proteiner underlättar RNA-måligenkännande och producera ljuddämpningseffekten. Alla RNA knockdown teknik gynnas av anpassningsbara karaktären av syntetiska sRNAs, som lätt kan tillverkas för att passa ett specifikt mål av intresse. Men de molekylära detaljerna i RNA upptag och tysta varierar kraftigt mellan modellsystem, begränsar var och hur RNA knockdowns kan tillämpas.
Hos nematoder, dubbelsträngat RNA (dsRNA) molekyler kan introduceras direkt i mediet eller genom att mata maskar med en population av dsRNA-uttryckande E. coli-celler 1,2. I Drosophila, kan RNAi åstadkommas genom microinjecting embryon med dsRNA 3, eller genomförs i cellinjer genom att helt enkelt lägga dsRNA till odlingsmediet 4. I däggdjurscellinjer,syntetiska små störande RNA (siRNA) kan levereras till levande celler genom elektroporation 1,2,5, förpackas i liposomer 3,6, eller uttryckt från DNA-plasmidvektorer 4,7. När väl RNA-slag når cytosolen förlitar sig RNAi pathway på RISC-komplexet för att bearbeta dsRNA, underlätta antisens igenkänning av målet, och katalysera translationell repression, mRNA nedbrytning eller heterokromatin bildning, beroende på värden.
På grund av dessa krav, kan klassisk RNAi endast utföras i organismer som tar upp exogen RNA effektivt och uttrycker RISC eller en RISC-liknande aktivitet. Noterbart utesluter detta modellen bakterien E. coli, som saknar den RNAi pathway. Men de senaste framstegen inom syntetisk biologi ger verktyg för att lösa både leveransproblem och tysta problemet.
I detta protokoll är Srna konstruktioner uttrycks i E. coli från en DNA-vektor som levereras till living celler med M13 fagemid / hjälpare systemet. En fagemid är någon plasmid med en fag-härledd f1 för replikation. En hjälpare plasmid, i det här fallet M13KO, bär alla maskiner som krävs för att producera viruspartiklar, men är inte i sig behörig för replikering och packning. När en fagemid och hjälpare plasmid samtransformeras är fagemiden ensam replik på f1 ursprung, förpackas och utsöndras. Den vektoriserade fagemiden är då behörig att infektera levande E. coli via F pilus.
I detta system är den ljuddämpande effekten som produceras av anpassade sRNA kassetter som kombinerar en byggnadsställning sekvens med en målbindande sekvens. Den målbindande sekvensen är 24 baspar antisens till en mRNA-mål, typiskt vid den ribosom-bindningsstället (RBS). Ställningen sekvensen, som utvecklats av Na och kollegor 8 innehåller en Hfq bindande motiv utvinns ur MICC, en liten reglerande RNA endogen till E. coli. Den Hfq proteinet stimulerar RNA-RNA binding och mRNA nedbrytning, som betjänar en roll i detta system liknande RISC i RNAi. Figur 1 visar en komplett system för fag-medierad Srna knockdowns, inklusive sRNA kassettstrukturen, fagemid vektorisering och tysta mekanism.
Som ett förfarande för att modulera genexpression i E. coli, sRNA ljuddämpning är enkel, snabb och mångsidig. Den riktade E. coli inte belastas utöver föröknings fagemiden och uttrycka sRNA. Detta kan vara relevant i samband med syntetisk biologi eller grundforskning där uttrycket av större heterologa konstruktioner kan anstränga cellulära resurser 9. Fagemider med nya mål kan framställas med en enda PCR och skördades en dag efter fagemid transformation. Slutligen kan nästan alla mRNA riktas. Den sRNA förordningen kassett (på en standard plasmid) har visat sig fungera på en mängd olika mål i ämnesomsättningen med typiska förtryck nivåer> 90% 8.
10. För det första är en förpackad fagemid introduceras till en satsvis odling av E. coli-celler och som används för att tysta expression av det fluorescerande proteinet mKate2. Efterföljande fluorescensförändringar övervakas i realtid. För det andra, knacka ner CAT-genen har visat sig minska fenotypisk kloramfenikolresistens på agarplattor. I båda fallen fagemiden själv bär en GFP markör, vilket gör att infektioner som skall mätas oberoende av knockdown effektivitet.
1. Design och konstruktion av fagemidvektorer Bearing sRNA Ljuddämpning Kassetter
2. Produktion och Skörd av M13-förpackade Fagemidpartiklar Stocks
3. Framställning av F + målceller för Ljuddämpning
4. Infektion med pakete Fagemider för att tysta
Tysta mKate2 fluorescens i Liquid Media
Figur 1 visar systemet för sRNA-förmedlade knockdowns som beskrivs i detta arbete, inklusive sRNA kassett design, fagemid vektorisering och tysta mekanism. Följande protokoll 1,2 ades sRNA tysta kassetten av plasmid pAB.001 ändras för att rikta mKate. Den sRNA kassetten syntetiserades och klonades i fagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP, en gåva från Monica Ortiz och Drew Endy 11. Denna fagemid bär markörer för GFP uttryck och kanamycinresistens, vilket gör framgångsrika infektioner kan spåras. Paketerade fagemid lager framställdes enligt protokoll 2.
Ett derivat av E. coli K12 MG1655 som bär en konstitutivt uttryckt, kromosomalt integrerad mKate2 markör framställdes för faginfektion genom konjugering med en F-plasmid donatorstam följande protokoll 3. Cellerna odlades till mitten av log-fasen och fagemiden infördes följande protokoll 4. Efter fagemid infektion, var 200 | il kulturer överfördes till en fluorescensplattläsare och fluorescens övervakades kontinuerligt under 24 timmar.
Figur 3 visar effekten av sRNA-medierad tysta på mKate2 uttryck. Stammen infekterade med en anti-mKate2 fagemid visade ingen detekterbar mKate2 fluorescens över bakgrunden. I motsats, denna stam gjorde uttrycka GFP markör, indikerar framgångsrik upptag av fagemiden. Oinfekterade kontrollceller producerade mKate2 fluorescens men inte GFP. En ytterligare kontroll, där anti-mKate2 inriktning domänen ersattes med en sekvens inriktning CAT, hade ingen effekt på mKate2 fluorescens.
Tysta av kloramfenikolresistens på agarplattor
innehåll "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Efter protokoll 1,1, en sRNA tysta kassett producerades att rikta CAT A-derivat av E. coli K12 MG1655 som bär en konstitutivt uttryckt, var kromosomalt integrerad CAT markör beredd på. faginfektion genom konjugering med en F-plasmid donatorstam följande protokoll 3. cellerna odlades till mitten av log-fasen och fagemiden infördes följande protokoll 4. efter en timme av inkubering vid 37 ° C, infekterades cellerna seriespäddes och ströks ut vid en utbud av kloramfenikol koncentrationer. Plattorna inkuberades över natten, och andelen resistenta celler vid varje kloramfenikol koncentration bestämdes genom att räkna kolonibildande enheter (CFU) nästa dag.Figur 4 visar effekten av sRNA-medierad ljuddämpning på kloramfenikolresistens fenotyp. Oinfekterade celler eller celler som infekterats med fagemid targeting mKate2, var resistenta motkloramfenikol vid alla testade koncentrationer. I kontrast, celler infekterade med fagemid targeting CAT visade minskad överlevnad vid låga kloramfenikol koncentrationer, och nästan 99% dödande vid högre koncentrationer. Tillsatsen av ampicillin, för att välja endast bakteriebärande fagemiden, minskade kloramfenikol överlevnad till omätbara nivåer. Detta överensstämmer med tidigare arbete som visar att fly från fag-infektion är en vanlig väg att undkomma ljuddämpnings 10.
Figur 1: geners i E. coli med sRNA Expression kassetter levereras av M13-fag Den sRNA kassetten består av 4 moduler:. PR-promotorn (en konstitutiv promotor från bakteriofag lambda), en 24 bp inriktning domän, en Hfq bindande domän som extraherats från MICC och en transkriptionsterminator 8 E. coli som uttrycker F pilus, där sRNA expression börjar. Den sRNA rekryterar sedan Hfq protein (visas i rött) och binder en antisens-mRNA mål nära ribosombindningsstället, vilket resulterar i translations förtryck och mRNA nedbrytning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Primer Design och ställesriktad mutagenes av sRNA målstället Två primrar är utformade med partiell homologi till en befintlig sRNA kassett. Den framåtriktade primern innehåller 20 bp homolog med pR-promotor vid 5'-änden, följt av24 bp som representerar den nya styrsekvens, därefter 18 bp homolog med Hfq bindande domän vid 3'-änden. Den omvända primern är den exakta omvända komplementet till den framåtriktade primern, med regioner av homologi till den befintliga sRNA kassetten flankerar det omvända komplementet av den nya styrsekvens. Exakta primersekvenser ges i Tabell 3. Separata single-primer PCR-reaktioner med den framåtriktade och den bakåtriktade primrarna producerar linjär, enkelsträngad DNA med den önskade modifierade sekvensen. Glödgning av framåt och bakåt reaktionsprodukter efter sanering som beskrivs i protokollet, resulterar i dubbelsträngad plasmid-DNA som bär den önskade modifierade sRNA kassett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Knockdown av en kromosomalt integrerad mKate2 Fluorescerande Reporter. E. coli MG1655 K12 uttrycker mKate2 lämnades antingen obehandlade (röda linjer och barer), infekterade med en anti-mKate2 fagemid (gröna linjer och barer), eller infekterade med en styr fagemid inriktning CAT (blå linjer och barer). (A) Obehandlad E. coli växte till högre mättnadstäthet, vilket tyder på en metabolisk kostnad för fag-infektion. Streckade linjerna indikerar standardavvikelser för 3 replikat. (B) mKate2 signalen reducerades till nära bakgrundsnivåerna i anti-mKate2 behandlade stammen, men inte i kontrollstammar. (C) GFP fluorescens, transporteras också av fagemiden, kunde påvisas endast i fagemid-behandlade kontroller. (D, E) Slutliga fluorescensavläsningar efter 24 timmar av tillväxten normaliserades till OD. GFP signal, som indikerar fagemid infektion, var frånvarande i obehandlade kontroller, men också väsentligt reducerad efter anti-CAT phagemid behandling. Detta kan tyda på off-target effekterna av fagemiden. Den mKate2 signalen reducerades med anti-mKate2 fagemid-behandling jämfört med obehandlade kontroller. CAT-riktade kontroll fagemid visade ingen effekt på mKate2 fluorescens. Felstaplar representerar standardavvikelsen för 3 replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Knockdown av CAT Åter Chloramphenicol Känslighet för en genetiskt resistent Population E.. coli MG1655 K12 uttrycker en kromosomalt integrerad CAT-gen lämnades obehandlade (röda staplar), behandlades med en kontroll fagemid inriktning mKate2 (gröna staplar) eller behandlas med en fagemid som uttrycker en anti-CAT sRNA (blå staplar). Efter en timme av infektion, lönsamhet på den angivna antibiotics bedömdes genom seriespädningar och plätering. Stammar som behandlats med anti-CAT fagemid signifikant dödades (> 90%) av kloramfenikol vid högre koncentrationer, medan kontrollbehandlingar var opåverkad. Lägga ampicillin till odlingsplattor väljer positivt för fagemid infektion och eliminerar oinfekterade celler. Under dessa betingelser, observerades inga kloramfenikolresistenta kolonier observerades efter anti-CAT-behandling. Detta tyder på att de flesta överlevande representerar ett fel på infektion, snarare än ett fel i tystande. Felstaplar representerar standardavvikelsen för 3 replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
CAT målsekvens | 5 '- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3' |
CAT GUIDE sekvens | 5 '- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3' |
Tabell 1:. Ett exempel TARGET och styrsekvens för CAT-genen Observera det omvända komplementet relationen.
pR-promotor | TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC | ||||
GUIDE sekvens | ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT | ||||
Hfq bindande domänen | TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG | ||||
T1 / TE-terminatorn | CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA |
Tabell 2:. Sekvens Komponenter i sRNA Cassette Varje sekvens är skriven 5'-3 '. Den kompletta kassetten är en sammansättning av dessa 4 element i ordning och omfattar 292 bp.
Forward Primer | 5 '- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3' |
Reverse Primer | 5 '- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3' |
Tabell 3: Primer Design att påverka de befintliga styrelement Den främre primern innehåller de sista 20 bp av pR-promotor, den nya styrsekvens, och det första 18 bp av Hfq-bindande domänen.. Målsekvensen är den exakta omvända komplementet till GUIDE sekvensen. Den omvända primern är den exakta omvända komplementet till den framåtriktade primern.
Tabell 4: Föreslagna Villkor för Single-Primer mutagen PCR.
Steg | temp | Tid |
initial denaturering | 98 ° C | 30 sek |
30 cykler | 98 ° C | 10 sek |
55 ° C | 30 sek | |
72 ° C | 120 sek | |
slutlig förlängning | 72 ° C | 300 sek |
Lagring | 10 ° C |
Tabell 5: Föreslagna Termo protokollet om Single-Primer mutagen PCR.
Komponent | Volym |
mall-DNA | 1 pl |
10 | iM Forward Primer | 0,5 ^ |
10 | iM Reverse Primer | 0,5 ^ |
Taq 2X Master Mix | 25 ^ |
Nukleasfritt water | 23 | il |
total volym | 50 ^ |
Tabell 6: Föreslagna villkor för sekvensverifiering PCR.
Steg | temp | Tid |
initial denaturering | 95 ° C | 30 sek |
30 cykler | 95 ° C | 30 sek |
55 ° C | 30 sek | |
68 ° C | 30 sek | |
slutlig förlängning | 68 ° C | 300 sek |
Lagring | 10 ° C |
Tabell 7: Föreslagna Thermocycler Proprotokoll för sekvensverifiering PCR.
Föreliggande förfarande uppnås 80% minskning av mKate fluorescens nivåer jämfört med oriktade kontroller. Detta är i linje med andra RNA-knockdown metoder, där hela ljuddämpnings inte observeras och 50-90% verkningsgrad är typiskt 16,17. På fenotypisk nivå, CAT inriktade knockdowns kunde avsevärt dämpa kloramfenikolresistens och eliminera det under vissa förhållanden.
Den knockdown fenotyp kunde detekteras på befolkningsnivå efter bara några timmar efter infektion (Figur 3B). Detta illustrerar en viktig egenskap hos fag-baserade leverans: en hög knockdown frekvens kan erhållas direkt i satsvis odling utan föregående genetisk modifiering. Till skillnad från konventionella genetiska modifieringar som använder plasmid transformation eller genomisk integration, inte fag infektionen inte kräva att en population åter vuxit från en enda isolerad koloni. Detta tillåter effekterna av faginfektion vara explored i populationer med komplexa rumsliga dynamik 11, med redan existerande rumsliga strukturer som biofilmer 18, eller i genetiskt blandade naturliga populationer 19.
Ett kritiskt steg i denna metod är framställningen av förpackade fagemid med hög titer. Den metaboliska bördan i samband med produktion fagpartikel kan leda till höga mutation eller plasmid förlust i fagemiden produktionsstammen. Det rekommenderas att fagemid produktionsstammen odlas direkt från en enda samtrans koloni och inte kylda, frysta eller under odlas före fag skörd. En låg effektivitet av co-transformation kan också iakttas vid införandet av fagemiden och hjälpare plasmid till E. coli samtidigt. I detta fall kan högre effektivitet erhållas genom transformering av hjälpar-plasmiden först och sedan framställa kompetenta celler som är försedda med hjälpar-plasmid för efterföljande transformation med fagemiden.
Phagemid infektion eller sRNA uttryck innebär också en påvisbar metabolisk börda för målceller, och kan resultera i viss fenotypisk störning. Till exempel var en minskning av mKate2 fluorescens observerades även när cellerna infekterades med en fagemid inriktning CAT (Figur 3). Infektion med M13 är inte tänkt att utlösa systemstressreaktioner i E. coli 20, men kan förändra transkriptionsmönster indirekt. Alternativt kan GFP eller ampicillin resistensmarkörer inkluderade på fagemiden konkurrerar om cellulära resurser, vilket minskar mKate2 uttryck och tillväxt 9. Slutligen kan sRNA själva kassetten globalt förändra genuttrycksprofilerna genom titrering av Hfq proteinet, eller genom off-mål-mRNA ljuddämpning. Från målet effekter är vanliga i in vivo RNAi inriktning 21-23, men de har ännu inte utretts systematiskt för det här systemet.
En begränsning med denna metod är att infektionen effiteten är mindre än 100%, vilket gör att vissa icke-infekterade bakterier att kvarstå i populationen. Resultatet av detta arbete och tidigare arbete 10 tyder på att icke-infekterade celler representerar 1-10% av den slutliga befolkningen, och är ansvariga för de flesta av de nonsilenced fenotyper observerats. En mängd olika vägar till M13-motstånd är kända, med de vanligaste är mutations förlust av pilus uttryck 24. Mot bakgrund av dessa begränsningar, bör kontroller användas för att bekräfta höga infektionshastigheter och knockdown effektivitet.
En annan potentiell begränsning för vissa tillämpningar är tillfällig överföring av kontamine hjälparfag. Även M13K07 innehåller en muterad packningssignal, kan den förpackas i fagkapsiden vid låg frekvens och överförs till infekterade populationer, vilket resulterar i celler som är behöriga för fagproduktion och fortsatt spridning av fag bortom den initiala infektionen händelsen 25. Modifieringar av hjälparfag har visat sig effektivaatt minska ospecifik förpackningar, även om det ibland på bekostnad av minskad fagproduktion 26.
Konstruerad bakteriofager har blivit ett oumbärligt verktyg för E. coli syntetisk biologi, vilket möjliggör snabb leverans av nya gener till en växande befolkning. Senaste arbete har producerat interkommunikationskretsar 11 eller uttryckt transkriptionsfaktorer för att undertrycka antibiotikaresistens vägar 27. Protokollet presenteras här bidrar till en växande samling av verktyg som gör kontroll av bakteriell fysiologi genom programmerade RNA. Crispr-Cas nukleaser, när muteras för att eliminera nukleasaktivitet, har visat sig undertrycka transkription vid RNA-styrda genmål 17,28. I motsats härtill arbetar sRNA tystande på den translationella nivån och inte kräver exogen proteinuttryck. Nästa generations bioteknik kan förena transkriptionell och translationell kontroll med fag-medierad leverans att programmera komplexa Fenoltyper i realtid.
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen av detta arbete lämnades av Fondation Bettencourt Schueller stöd för Paris Bettencourt iGEM laget. Vi tackar INSERM U1001 forskningsenheten och Chantal Lotton för tekniskt stöd och rådgivning. Fagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP från Monica Ortiz och Drew Endy av Stanford.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved