Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Leverhulme Trust, de Techniek en Physical Sciences Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] en Medical Research Council [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Wij danken E. Avezov en M. Lu voor transfectie van de LifeAct-GFP en cytosolische GFP-cellen respectievelijk, en W. Chen voor de voorbereiding van de HEK293 cultuur. We danken ook K. O&#39;Holleran voor hulp bij het ontwerp van de microscoop, en L. Shao en R. Heintzmann voor nuttige discussies en suggesties.

1. Het organiseren en uitlijnen Opwinding Path <ol><li> De posities van de componenten op de optische tafel (zie figuur 1 voor een overzicht van de optische opstelling). Scheid de doelstelling, lenzen L3, L4, L5, en de SLM elk door de som van hun brandpuntsafstanden zodat het SLM oppervlak wordt doorgegeven op het brandvlak van het objectief. </li><li> Plaats multi-edge dichroïsche spiegel DM4 in het filter kubus torentje van de microscoop frame. </li><li> Steek de tweede dichroïsche spiegel DM3 in een 1 &quot;vierkant kinetische spiegel te monteren, en plaats het een brandpuntsafstand uit de buurt van de condensor lens L5. Let op: Dit excitatie pad ontwerp neemt twee identieke dichroïsche spiegels DM3 en DM4 die zijn overgenomen uit dezelfde productie-batch aan uniforme optische eigenschappen. De dichroïsche spiegel (DM4) zodanig is geplaatst dat de s- en p- assen geschakeld vergeleken met de dichroïsche in de microscoop (DM3) hierdoor een annulerenpolarisatie ellipticiteit geïntroduceerd door de dubbele breking (figuur 1). Deze compensatie werkt net zo goed voor elke golflengte verlichting. Deze stap is essentieel voor hoge modulatie contrast. </li><li> Alvorens de lenzen in het excitatiepad nauwkeurig definiëren de optische as van het systeem. <ol><li> Verwijder het objectief (OB) van de toren en in plaats daarvan schroef in een uitlijning tool. Deze bestaat uit een 500 mm lange optisch systeem kooi met twee schijven aanpassing aan beide uiteinden. </li><li> Gebruik de dichroïsche spiegel DM3 en tijdelijke afstemming spiegel geplaatst op de geschatte latere locatie van de SLM een gecollimeerde referentiebundel van Laser 1 sturen door het midden van de gaten in de twee alignment schijven. Richt de straal van Laser 1 tot tijdelijke spiegel zoals in figuur 1 met behulp van drie spiegels en dichroïsche spiegel DM2. De tijdelijke spiegel aan de SLM moet zo dicht bij loodrecht op de optische as daarvan. <li> Verwijder de pasgereedschap zodra de grove optische as determined.Insert een iris in de laserstraal pad is geweest voordat het de microscopie lichaam binnenkomt en centreren op de balk. Bevestig een stuk van de witte kaart met een klein gat gecentreerd op de iris.Reinsert het objectief (OB). Opmerking: De bundel verlaat het doel zal nu zeer uiteenlopend zijn, maar er zal een zeer zwakke reflectie van het achteroppervlak van de lens die zichtbaar is op de witte kaart. Alle lenzen, zelfs als ze anti-reflectiecoating, zwak zal terug reflecties die kunnen worden gebruikt om coaxiale uitlijning hebben. Als de bundel precies loodrecht op de lens dan zal de reflectie weer terug door het centrum van de iris </li><li> Maak iteratieve hoekige aanpassingen aan de twee spiegels (DM3 en afstemming spiegel aan de SLM positie) naar de achterkant reflectie op centrerende kaart met de binnenkomende bundel. Verwijder tijdelijk de objectieflens (OB) en markeer de laserspot op het plafond van een referentiepositie maken. </li><li> Plaats een paar irissen ter hoogte van de referentiebundel langs de draadgaten van de tafel. De bundel parallel met het oppervlak van de optische tafel. De optische as wordt nu gedefinieerd. </li></ol></li><li> Plaats de condensor lens (L5) ruwweg een brandpuntsafstand van het objectief. Monteer deze lens op een lineaire translatie decor te vertalen in de richting van de referentie-bundel. </li><li> Pas de condensorlens positie en hoek zodanig dat de bundel verlaat het doel gecollimeerd en raakt de referentievlek op het plafond. Controleer of de lens loodrecht op de bundel door opnieuw controleren van de achterbezinningsverlies de iris en witte kaart. Verwijder het objectief (OB) en plaats de tweede lens van het beeld relais telescoop (L4). NB: zorgen voor de juiste collimatie en non-doorbuiging van de team wordt vergemakkelijkt wanneer er een even aantal lenzen in de stralengang. </li><li> Pas de positie en de hoek van deze lens met een lineaire translatietafel collimatie te houden en te zorgen voor de referentiebundel raakt nog de gemarkeerde plaats op het plafond. </li><li> Vervang het objectief (OB) en plaats de eerste lens van de telescoop (L3). Pas de positie en de hoek van deze lens voor collimatie en niet-afbuiging waarborgen, zoals in vorige stappen. </li><li> Monteer de SLM chip op een cardanische mount die rotatie biedt zonder vertaling over het midden van de chip oppervlak. Opmerking: De specifieke plaats ontwerp hangt af van de gebruikte SLM. Als de SLM wordt zonder mount, moet worden bevestigd aan een aangepaste gefreesd aluminium plaat die vervolgens wordt bevestigd aan een cardanische lens mount. </li><li> Met de lenzen uitgelijnd, plaatst u de SLM in de plaats van de spiegel. Stel de positie van de SLM zodat de referentiebundel is gelegen in het midden van de SLM-chip, en stel de eengle zodat de bundel passeert door de twee relais lenzen (L3 en L4). Controleer of de referentie-bundel is nog steeds gericht op de gemarkeerde plaats. </li><li> Uitbreiden en collimeren de referentie-bundel met behulp van een Kepleriaanse beam expander. <ol><li> Monteer de twee lenzen (L1 en L2) in een kooi voor gemakkelijke aanpassing. </li><li> Centre de kooi systeem op de referentie-bundel door het verwijderen van de lenzen en te vervangen door irissen. </li><li> Plaats de twee lenzen en stel de axiale positie van L2 naar de geëxpandeerde bundel met een afschuifinterferometer collimeren. L2 moet men brandpuntsafstand van het oppervlak van de SLM worden. </li><li> Controleer of de uitgebreide bundel is nog steeds gecollimeerd na de twee relais lenzen L3 en L4. Gebruik het scheren interferometer net na DM3 te controleren op collimatie. </li></ol></li><li> Zodra de excitatie pad is afgestemd voor een enkele golflengte, het koppelen van de andere twee lasers in de laserstraal pad. Steer elke balk door middel van twee irissen gecentreerd op de excitatie pad metde bundel combineren dichroïsche spiegels (DM1 en DM2). </li></ol> 2. Aanpassing van de Polarisatie Rotator <ol><li> Monteer de LCVR met de snelle as 45 ° met de invallende polarisatie. </li><li> Fine-tunen van polarisatie hoek van de bundel incident aan de LCVR met behulp van een achromatische halve golf plaat (HWP) door het invoegen van de HWP en de LCVR tussen gekruiste polarisatoren. Draai de HWP om de uitgezonden vermogen te minimaliseren. Opmerking: Om te werken als een variabele polarisatiedraaier, moet de snelle as van het vloeibaar kristal retarder (LCVR) nauwkeurig uitgelijnd op 45 ° met de invallende bundel vertikale polarisatie. De LCVR fysiek bevestigd aan 45 °, maar dit is slechts een grove uitlijning. De HWP wordt gebruikt voor een perfecte 45 ° uitlijning van de invallende polarisatie ten opzichte van de LCVR snelle as. De kwart golfplaat (QWP) zet de gekantelde elliptische polarisatie geïnduceerd door de LCVR terug naar lineaire polarisatie in een hoek gecontroleerd door de aangelegde spanning24. </li><li> Steek de QWP na de LCVR en draai het naar zijn langzame as af te stemmen op de inkomende polarisatie door het minimaliseren van het uitgezonden vermogen tussen gekruiste polarisatoren. </li></ol> 3. Aanpassing van de Emissie Path <ol><li> Grof de positie van de camera met behulp van een micrometerverdeling en doorgelaten licht. <ol><li> Focus op het dradenkruis met behulp van de microscoop oculairs en bevestig het objectief op deze positie. </li><li> Ruwweg centreren de camera en zet de camera positie om het beeld van het vizier scherp te stellen door het observeren van het beeld op het scherm. Opmerking: Als een extern filter wiel wordt gebruikt, de filter kubus zal een emissie filter bevatten, dus de oculairs mag niet worden gebruikt bij lasers zijn ingeschakeld. </li></ol></li><li> Fijn stel de camera positie met behulp van een fluorescerende kraal monster. <ol><li> Bereid een monolaag van fluorescerende kralen door het verspreiden van een druppel van 100 nm multicolor kralen op een dekglaasje # 1,5. Laat dry om de kralen om de dekglaasje adsorberen en vervolgens opnieuw onderdompelen in water. </li><li> Plaats de kraal monster op het doel met immersie olie. Fijn aanpassen van de positie van de camera, zodat de fluorescerende kraal laag is scherpgesteld. Mis het objectief standpunt niet aanpassen nadat de focus is gevonden. Opmerking: Als de SLM moet in een vlak conjugaat aan het monstervlak, de positie van de SLM, relais lenzen en objectief worden bepaald. Om scherp te stellen, verplaatst het monster axiaal in plaats van de doelstelling van het gebruik van een piëzo z-podium. </li></ol></li><li> Genereren van de juiste SIM binaire rooster patronen als bitmap-bestanden. <ol><li> Voor 2D / TIRF-SIM, het genereren van een reeks van 9 binaire raster beelden: 3 patroon oriëntaties met elk 3 gelijke afstand faseverschuivingen. Genereren deze numeriek (met MATLAB bijvoorbeeld) van een geroteerd 2D sinusoïde met een faseverschuiving toegepast, dan drempelvorming een binair beeld te produceren. Zie Aanvullende Code Files bijvoorbeeld code. </li><li> voor alignment doeleinden, ook leiden raster patronen die zijn windowed door een kleine cirkelvormige opening voor elk van de 3 oriëntaties, zoals getoond in figuur 2. De vensters uitlijning roosters hoeven niet extern worden geactiveerd maar kan handmatig worden geschakeld door de gebruiker via de SLM&#39;s software. Opmerking: Zie referenties voor een bespreking van de optimale rotatiehoeken en een voorbeeld van roosterpatroon generatiecode 16,20. </li></ol></li><li> Upload de bitmap beelden naar de SLM met behulp van software van de fabrikant (bijvoorbeeld MetroCon). <ol><li> Laad de SLM besturingssoftware en klik op &quot;Connect&quot;. </li><li> In het tabblad &quot;Repertoire&quot;, klikt u op &quot;Load&quot; aan het repertoire bestand te openen en controleer het nummer van Running Orders in het dossier. In het voorbeeld repertoire bestand gegeven zijn er vijf Running Orders. </li><li> Klik op &quot;Send to board&quot; om het repertoire bestand naar de SLM te uploaden. </li><li> Wacht tot de bitmap beelden te uploaden eennd voor het apparaat automatisch opnieuw op te starten. Opmerking: Een voorbeeld repertoire bestand, dat raspen bitmapafbeeldingen en een bestand definiëren van de order bevat, is opgenomen als een aanvullend Code File. De &quot;.repz&quot; bestand kan worden geopend met behulp van ZIP-bestand archiver software. </li></ol></li><li> Toon een windowed uitlijning rooster op de SLM voor de eerste oriëntatie (bijvoorbeeld 0 °). <ol><li> In de SLM besturingssoftware, selecteer het tabblad &quot;Status&quot;, voer het nummer van de Running Orde (in het geval van het voorbeeld bestand, dit is rijklare toestand &quot;1&quot;). </li><li> Klik op &quot;Select&quot; om de Running Order om de uitlijning rooster te veranderen. Opmerking: Dit zal een klein cirkelvormig gebied te verlichten in het monster vlak. Als de SLM oppervlak correct is geconjugeerd aan het monster vlak daarna zal de randen van deze regio sterk worden scherpgesteld. Het rooster patroon zal meerdere diffractie-ordes te produceren in het brandpunt van L3: de nulde orde reflectie van de reflecterende backplane van deSLM, de -1 en +1 orders overeenkomt met het rooster, en ook zwakkere hogere orden die ontstaan ​​door verstrooiing van interne componenten specifiek voor de SLM (bijv. Reflecties van de interne bedrading van de SLM pixels en onregelmatigheden pixel randen) . Alles behalve de -1 en +1 bestellingen moeten worden uitgefilterd. </li></ol></li><li> Plaats een ruimtelijke masker (SM) gemonteerd in een x, y fase in de lichtbaan van het brandpunt van L3, en vertalen de positie ten opzichte van de optische as, zodat alleen de gewenste eerste opdrachten worden doorgegeven. Direct na het ruimtelijk filter, zal slechts twee cirkelvormige bundels zichtbaar. Opmerking: De ruimtelijke masker wordt gefabriceerd door ponsen 6 gaten in aluminiumfolie met behulp van een naald. De gaten groot genoeg zijn om de eerste orde bundels passen voor laser-golflengten. Een gedetailleerde analyse van de ruimtelijke masker wordt gegeven in referentie 20. </li><li> Toont de volgende oriëntatie van de uitlijning rooster (60 °, rijklare 2) en opnieuwervoor te zorgen dat alleen de eerste bestellingen worden verhuurd door de ruimtelijke masker, het aanpassen van zijn positie, indien nodig. </li><li> Herhaal dit voor de uiteindelijke oriëntatie (120 °, rijklare 3). </li><li> Controleer het beeld van de fluorescerende kraal laag op de camera. Als de twee cirkelvormige bundels elkaar niet overlappen zoals weergegeven in figuur 2 daarna anders het monstervlak door iteratief aanpassen van de objectieflens en camerapositie. </li><li> Stel het doel positie om de twee bundels die het beeld zal brengen onscherp overlappen. De positie van de camera om het beeld terug in focus en fine-tunen van de doelstelling in het geval brengen twee cirkels zijn nog zichtbaar. Herhaal dit proces tot de twee bundels elkaar overlappen en één cirkelvormig gebied is scherpgesteld. </li><li> Zodra de positie van het monstervlak is ingesteld, houdt de objectiefpositie gefixeerd. </li><li> Afbeelding aan TIRF verlichting bevestigen een oplossing van fluorescente kleurstof, bijvoorbeeld bij een excitatiegolflengte 488 nm, gebruik een oplossing van 1081; M rhodamine 6G. <ol><li> Breng de kleurstof monster in focus. Als de twee bundels incident bij de juiste TIRF hoek dan zullen enkele moleculen zichtbaar zonder hoge achtergrond, en de randen van de cirkelvormige opening zal worden scherpgesteld. Zie figuur 2B-D voor voorbeelden van op elkaar afgestemd en uitgelijnd TIRF balken. </li><li> Tonen elke oriëntatie van de windowed roosters op zijn beurt en ervoor te zorgen dat alle drie oriëntaties bieden TIRF verlichting en dat de twee stralen elkaar overlappen op het monster vlak. Fijnafstelling van de positie van de balken kan worden gemaakt door het aanpassen dichroïsche spiegel DM3. Noot: Hoewel verschillende golflengten zijn gericht op iets verschillende posities door axiale chromatische aberratie, is niet kritisch en kan worden gecorrigeerd door een constante z-offset naar monsterpositie vóór excitatie met de tweede golflengte. </li></ol></li></ol> 4. Systeem Synchronisatie en kalibratie <ol><li> Plaats de kraal monolaag svoldoende op de doelstelling en brengt in beeld. </li><li> Programmeer de SLM met behulp van de besturingssoftware voor elk van de 3 faseverschuiving beelden weer te geven, het eerste patroon richting (0 °). <ol><li> Met behulp van de SLM control software, schakelt naar Running Orde 4 van het voorbeeld repertoire. </li><li> Configureren van de camera met behulp van de acquisitie software (bijvoorbeeld HCImage) om de productie twee signalen: een positieve en een negatieve TTL trigger-signaal tijdens de wereldwijde periode van blootstelling. In de camera software, onder &quot;Advanced Camera Properties&quot;, stelt Output Trigger Kind 1 en 2 om &quot;Exposure&quot;, en Output Trigger Polariteit 1 en 2 om &quot;positieve&quot; en &quot;negatieve&quot; respectievelijk. </li><li> Verbind Output 1 en 2 van de camera naar de &quot;trigger&quot; en &quot;Finish&quot; ingangen van de SLM, respectievelijk, met behulp van coax-kabels. De SLM is nu gesynchroniseerd met de camera. </li></ol></li><li> Het verwerven van een reeks van 3 beelden. <ol><li> In de &quot;Sequence&quot; venster, kies &amp;# 34; Hard Disk Record &#39;, zoals het scantype, en zet de telling frame 3. </li><li> Klik op &quot;Start&quot; om 3 frames te verwerven. De SLM patroon verandert bij elke blootstelling. De fluorescerende kralen in het beeld zal verschijnen om aan en uit knipperen tussen elk van de 3 afbeeldingen. Het bedrag van de knipperende is een uitlezing van de modulatie contrast van de sinusvormige verlichting patroon. </li></ol></li><li> Draai de polarisatie van de excitatielaser de LCVR met aangepaste software om azimutale polarisatie en derhalve de hoogste modulatie contrast voor het gegeven patroon oriëntatie bereiken. <ol><li> Laad de LCVR kalibratiesoftware. </li><li> Voer 0 en 8 voor respectievelijk de minimale en maximale spanning. </li><li> Klik op &quot;Sweep LCVR Voltage&quot; om de polarisatie te draaien. Opmerking: De retardantie LCVR is een functie van de temperatuur en kan dag tot dag drift zelfs met temperatuurregeling. In deze stap wordt een optimale azimutale polarisatie empirisch gevonden door Sweeping de aangelegde spanning tussen de minimale en maximale spanning die het effect van rotatie van polarisatie incident op het monster. De modulatie contrast wordt berekend voor elke spanning 25 en de spanning die bereikt piekcontrast wordt gebruikt in de volgende stappen. </li><li> Wacht tot de kalibratie is voltooid, en noteer de gemeten spanning. </li></ol></li><li> Herhaal dit kalibratieproces voor de overige twee oriëntaties patroon (60 ° en 120 °) en elk van de golflengten. </li><li> Synchroniseer de belichting met de LCVR, lasers, emissie-filter wiel en piëzo z-fase 26. Om dit te bereiken, gebruik dan een high speed data-acquisitie (DAQ) board als de master klok bron voor het systeem, en gebruik de SLM LED Enable uitgangssignaal naar de lasers te moduleren (zie figuur 3B). Opmerking: De specifieke implementatie is afhankelijk van de gebruikte componenten, maar het gebruik van een hoge snelheid DAQ kaart voor digitale trigger synchronisatie en regeling van de LCVR een analoge spanning via de software, aanbevolen. De controle-software die wordt gebruikt in dit protocol is op aanvraag beschikbaar. </li><li> Door de axiale chromatische aberratie voor elke golflengte, ook voor az offset naar monstertafel. <ol><li> Bepaal experimenteel de offset door te focussen op een multicolor parel monolaag monster bij de eerste golflengte (bijv. 488 nm) en vervolgens over te schakelen naar de tweede (bijv. 640 nm). De kralen zal nu worden niet scherp. </li><li> Heroriëntatie van de kralen en meet de verandering in de Z-positie die nodig was. Deze offset kan dan telkens de excitatiegolflengte veranderd worden toegevoerd aan de piëzo z-fase. </li></ol></li><li> Met de SLM besturingssoftware, schakelt de SLM rijklare volledige reeks 9 binaire raster beelden vereist voor TIRF-SIM. Dit is rijklaar 0 in het voorbeeld repertoire. </li><li> Met behulp van de camera control software, verwerven 9 afbeeldingen van de kraal monster. <ol&gt; <li> In de &quot;Sequence&quot; ruit van de camera software, selecteer &quot;Hard Disk Record&quot; als het type scan, en verander de telling frame 9. </li><li> Klik op &quot;Start&quot; om beelden te verwerven. </li><li> Sla de verkregen beelden als TIFF-bestanden door &quot;TIFF&quot; het selecteren van het type afbeelding in het venster &quot;Save gebufferde Images&quot;, en klik op OK. </li></ol></li><li> Reconstrueren van een super-resolutie uit het ruwe TIFF-afbeeldingen met behulp van commerciële of aangepaste software voor de verbetering van de resolutie ten opzichte van standaard TIRF valideren. Opmerking: Voor onze microscoop gebruiken we aangepaste reconstructie code ontwikkeld, zowel in-house en door Dr. Lin Shao 27. </li></ol>

<ol>
	<li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+modulated+excitation+microscopy:+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement.">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li><li>Davies, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYK4+Promotes+Antiparallel+Microtubule+Bundling+by+Optimizing+MKLP1+Neck+Conformation.">CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002121 (2015).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging.">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat. Commun. 6, 5980 (2015).</li><li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy.">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li><li>Esbj&#246;rner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observations+of+amyloid+&#946;+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A&#946;(1-40)+and+A&#946;(1-42)+aggregation.">Direct observations of amyloid &#946; Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of A&#946;(1-40) and A&#946;(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li><li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology.">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li><li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Super-Resolution+Imaging+of+&#946;-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo:+Method+and+Techniques.">Optical Super-Resolution Imaging of &#946;-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li><li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves.">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li><li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+resolution+wide-field+optical+imaging:+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945 (2006).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li><li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination.">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li><li>Brunstein, M., Wicker, K., H&#233;rault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks.">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li><li>F&#246;rster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator.">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663 (2014).</li><li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fastSIM:+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy.">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001 (2015).</li><li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples.">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li><li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging. , (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Meadowlark Optics Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Polarization Techniques and Devices. , (2005).</li><li>O'Holleran, K., Shaw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+effects+on+contrast+in+structured+illumination+microscopy.">Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy.</a> Opt. Lett. 37 (22), 4603 (2012).</li><li>Brankner, S. Z., Hobson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera. , (2013).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Wicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-iterative+determination+of+pattern+phase+in+structured+illumination+microscopy+using+auto-correlations+in+Fourier+space.">Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space.</a> Opt. Express. 21 (21), 24692 (2013).</li><li>Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-smooth+convex+optimization+for+an+efficient+reconstruction+in+structured+illumination+microscopy.">Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy.</a> 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).</li><li>Str&#246;hl, F., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+joint+Richardson-Lucy+deconvolution+algorithm+for+the+reconstruction+of+multifocal+structured+illumination+microscopy+data.">A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002 (2015).</li><li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns.">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li><li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm.">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723 (2013).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915 (2015).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics.">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Custom-built TIRF-SIM-systemen, zoals de setup die in dit protocol zijn in staat multicolor super-resolutie imaging met hoge snelheid in vergelijking met in de handel verkrijgbare microscopen. De inherente voordelen van SIM als een super-resolutie techniek is dat de temporele resolutie niet wordt beperkt door de fotofysica van de fluorofoor, vergeleken met andere methoden zoals moleculen lokalisatie microscopie (SMLM) of bijzondere scanmethodes zoals gestimuleerde emissie uitputting microscopie ( STED). In tegenstelling tot deze andere technieken, is SIM-kaart niet nodig photoswitchable of onuitputtelijk fluoroforen zo multicolor beeldvorming is eenvoudig. Niet TIRF-SIM systemen, zoals optische snijden SIM en multifocale SIM kan bereiken doorgaans resolutie verbeteringen van 1,7 keer of minder in een feitelijke de factor 2 verbeterd hier vermeld, en commerciële systemen zijn vaak langzamer en minder flexibel dan het systeem in dit protocol. &quot;&gt; De twee belangrijkste problemen bij de uitvoering van deze techniek zijn enerzijds de noodzaak van nauwkeurige positionering van de zes SIM bundels in de TIR zone achterkant apertuur doel, dat een bewerkelijk en vergt tijd in beslag optische uitlijning procedure. Ten tweede, hoge patroon contrast produceren bij het ​​monster, polarisatie draaiing van essentieel belang is. voor lage NA 2D-SIM-systemen, kan polarisatierotatie worden vermeden door zorgvuldige keuze van de lineaire polarisatie oriëntatie, maar wordt dit onmogelijk voor TIRF-SIM 25. voor high-speed multicolor beeldvorming, electro- optische polarisatieregeling noodzakelijk is en dit verhoogt de complexiteit en kosten van het systeem. Beperkingen van de techniek TIRF-SIM, als conventionele TIRF, is natuurlijk beperkt tot waarneming van biologische structuren en processen bij het basale celmembraan die kunnen worden verlicht door het 150-200 nm penetratiediepte van het verdwijnende veld. TerwijlSIM wordt vaak aangehaald als minder photodamaging cellen dan zowel STED of SMLM gaat laterale resolutie verdubbeling toch het vereiste aantal fotonen met tenminste 4 maal 5 in vergelijking met conventionele TIRF microscopie. Voor de beeldvorming bij hoge frame rates met een korte blootstelling keer, deze foton toename vereist het gebruik van een verhoogde verlichting intensiteiten. Hoewel elke fluorofoor kan worden gebruikt voor SIM beeldvorming van bewegende monsters vast of langzaam, hoge helderheid fluorescente proteïnen of volgende generatie synthetische kleurstoffen met verbeterde fotostabiliteit worden aanbevolen voor live cell imaging. Hoewel deze implementatie kan afbeelden van een enkele kleur op SIM framesnelheden dan 20 Hz is, wordt meerkleurige beeldvorming in de gepresenteerde systeem beperkt door de schakeltijd van de gemotoriseerde emissie filterwiel. Vanwege de grote omvang van de sCMOS camera chip, zou het gebruik van een multiband emissiefilter en het splitsen optica mogelijk zijn en mogelijk gelijktijdig imaging met meerdere golflengtes zonder snelheid boete. Een andere mogelijkheid is de verschillende excitatie lasers afwisselen en gebruik een multiband notch filter om het excitatielicht verwerpen. Het gebruik van een binaire ferroelektrische SLM in deze uitvoering is niet optimaal. De diffractie-efficiëntie van een dergelijke SLM is zeer laag, dus de meeste van het invallende licht is in de nulde orde reflectie die wordt weggefilterd door de ruimtelijke masker. Voor toepassingen die een zeer hoge frame rates, wordt de beeldvorming snelheid dus beperkt door het uitgangsvermogen van de laser diodes. De SLM wordt ook een aantal ellipticiteit in de polarisatie voor golflengten weg van de 550 nm golflengte ontwerp waarbij de pixels niet als ideale halve golf platen te bedienen. Hoewel dit naar zou worden gecompenseerd door een additionele LCVR, kan de ideale oplossing het gebruik van een digitale microspiegel inrichting (DMD) als patroongenerator zijn. eventuele wijzigingen De setup preseHier nted is flexibel en eenvoudig worden aangepast dan commerciële instrumenten zodat andere beeldvormingsmodaliteiten zoals 3D-SIM, snelle 2D-SIM, multifocale SIM (MSIM) en niet-lineaire SIM (NL-SIM) kan worden uitgevoerd 21,34,35. 2D-SIM kan goed geschikt voor het afbeelden van relatief vlak, snel bewegende structuren zoals perifere endoplasmatisch reticulum zijn. De perifere ER dieper ligt dan binnen de cel kan worden verlicht met een TIRF verdwijnende veld maar vanwege de vlakke structuur kan worden afgebeeld met behulp van standaard 2D-SIM met verwaarloosbare out-of-focus achtergrond. Bovendien kan het gebruik van verbeterde optische sectie reconstructiealgoritmes onderdrukken out-of-focus licht breiden het gebruik van 2D-SIM optisch dikke monsters, wanneer zij axiale resolutie verdubbeling is niet vereist 21. In MSIM wordt het monster verlicht door een dun rooster excitatie foci 36. Deze modaliteit kan worden uitgevoerd door eenvoudige verwijdering van de ruimtelijke masker (SM) En vervangen door een polarisator. De SLM heeft nu als een amplitude modulator. De binaire SIM roosters op het SLM kan worden vervangen door een 2D rooster vlekken, de grootte van de gekozen gelijk aan de omvang van een diffractie beperkte focus in het beeldvlak te plaatsen. In figuur 7A wordt een rooster van 4 x 4 pixelvierkanten op het SLM (inzet) die, wanneer demagnified op het monster genereert diffractie beperkte foci van 150 x 150 nm, gezien de fysieke SLM pixelgrootte van 13,62 urn. De excitatie foci vervolgens kan worden door het verschuiven van de rooster patroon op de SLM en dit wordt meerdere malen herhaald om het gehele gezichtsveld te verlichten. Beelden werden per vertaalde patroonpositie en de stapel nabewerkt tot een gereconstrueerd beeld met een betere resolutie van maximaal wijken voor een factor <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> en verminderde out-of-focus licht ten opzichte van het het equivalent groothoek tot30. Deze modaliteit kan nuttig zijn voor het afbeelden van dikke, dichte monsters waarvoor standaard SIM ongeschikt, bijvoorbeeld lage contrast structuren zoals gekleurd rode bloedcellen (figuur 7C), hoewel de acquisitietijd is toegenomen als gevolg van het grote aantal ruwe frames benodigde gezichtsveld (hier N = 168). Tenslotte kan de opstelling worden aangepast om ofwel hoge NA lineaire TIRF-SIM of gepatroneerde activering niet-lineaire SIM (PA NL-SIM) inschakelen, zoals onlangs door Li et al., Door gebruik van een ultrahoge 1,7 NA doelstelling of aanvulling van een 405 nm laser fotoactivatie en zorgvuldige optimalisering van de SLM raster patronen 35. toekomstige toepassingen SIM is nog steeds een zich snel ontwikkelende techniek en vele toepassingen in de life sciences zullen worden ingeschakeld in de toekomst. De snelheid, resolutie en contrast verbeteringen van de techniek en de mogelijkheid om met behulp van standaard fluoroforen mean dat Bio-imaging, SIM ingesteld op conventionele vele microscoopsystemen, zoals confocale en breedveld platforms vervangen. Commerciële SIM-systemen zijn reeds beschikbaar vandaag de dag met een uitstekende technische specificaties, maar ze zijn buiten het financiële bereik van vele onderzoekslaboratoria, en, heel belangrijk, ze zijn niet flexibel worden aangepast en ontwikkeld om de meest recente ontwikkelingen in het onderzoek op het terrein uit te voeren. Ze missen ook de essentiële mogelijkheid om &#39;worden aangepast voor het experiment bij de hand&#39;, vaak een kritisch knelpunt in cutting edge life science onderzoek. Het hier beschreven systeem zal bijzonder geschikt zijn om dynamische processen te bestuderen nabij het ​​celoppervlak, in vitro gereconstitueerde dubbellaag systemen voor oppervlaktechemie bestuderen in de materialen en natuurkunde, bijv. 2D materialen, en vele andere toepassingen.

In de afgelopen halve decennium heeft super-resolutie microscopie gerijpt en verhuisde van gespecialiseerde optica labs in de handen van de bioloog. Commerciële microscoop oplossingen bestaan ​​voor de drie belangrijkste varianten voor het bereiken van de optische super-resolutie: enkel molecuul localisatie microscopie (SMLM), gestimuleerde emissie uitputting microscopie (STED), en gestructureerde verlichting microscopie (SIM) 1,2. SMLM zoals Photoactivated Localization Microscopy (PALM) en stochastische optische reconstructie microscopie (Storm) hebben de meest populaire technieken geweest, grotendeels te danken aan de eenvoud van de optische opstelling en de belofte van hoge ruimtelijke resolutie, gemakkelijk tot 20 nm. Maar super-resolutie microscopie via single molecule lokalisatie wordt geleverd met een intrinsieke trade-off: de ruimtelijke resolutie haalbaar is afhankelijk van het verzamelen van een voldoende aantal individuele fluorofoor lokalisaties, vandaar beperking in de tijd resolutie. Imaging dynamisch proceses in levende cellen wordt derhalve problematisch als een voldoende beweging van de structuur van belang bewegingsartefacten voorkomen terwijl het verwerven genoeg lokalisatie gebeurtenissen in die tijd om een ​​beeld te reconstrueren moeten proeven. Om aan deze eisen te voldoen, zijn levende cellen SMLM demonstraties de vereiste toename fluorofoor photoswitching tarieven verkregen door aanzienlijke verhoging van de excitatie energie, en dit leidt weer tot fototoxiciteit en oxidatieve stress, waardoor monster overlevingstijden en biologische relevantie 3 beperkt. Een duidelijk voordeel van STED over zowel SIM-kaart en SMLM is dat het kan afbeelding met super-resolutie in dikke monsters, bijvoorbeeld laterale resolutie van ongeveer 60 nm werd bereikt in organotypische brain slices tot een diepte van 120 pm 4. Imaging op zo&#39;n diepte met één doel implementaties van SMLM of SIM is niet haalbaar, maar wordt mogelijk met zowel single-molecule licht plaat of rooster licht blad microscopy 5. Video-rate STED is ook aangetoond en gebruikt om synaptische vesikel mobiliteit kaart, hoewel dit tot nu toe beperkt tot kleine gezichtsveld 6 beeldvorming. Voor toepassingen in de celbiologie en zelfassemblage reacties moleculaire 7-12 die beeldvorming met hoge tijdsresolutie gedurende vele tijdstippen vereisen gestructureerde verlichting microscopie (SIM) kan geschikt als het is niet afhankelijk van de fotofysische eigenschappen van een bepaald fluorescentie sonde. Desondanks inherent voordeel van SIM, tot nu toe het gebruik ervan is voornamelijk beperkt tot gefixeerde cellen of langzaam bewegende processen beeldvorming. Dit komt door de beperkingen van commercieel beschikbare SIM systemen: het verwerven framesnelheid van deze instrumenten beperkt door de rotatiesnelheid van de rasters gebruikt om de vereiste sinusvormige verlichtingspatronen en de polarisatie optiek handhaven genereren. De nieuwste generatie van commerciële SIMinstrumenten zijn in staat om snel imaging, maar ze zijn onbetaalbaar om alle, maar de centrale imaging faciliteiten. Dit protocol geeft een indicatie voor de bouw van een flexibel SIM voor het afbeelden snelle processen in dunne monsters en nabij het basale oppervlak van levende cellen. Er werken in totaal interne reflectie fluorescentie (TIRF) om een verlichting patroon dat niet dieper dan ongeveer 150 nm in de steekproef 13 die sterk vermindert de achtergrond van de focus signaal doordringt te genereren. Het idee van het combineren SIM met TIRF is bijna zo oud als SIM zelf 14 maar niet experimenteel gerealiseerd vóór 2006 15. Eerste in vivo verkregen beelden met TIRF-SIM werden gerapporteerd in 2009 16 bereiken beeldfrequenties van 11 Hz tot tubuline en kinesine visualiseren dynamiek, en twee kleuren TIRF-SIM-systemen zijn gepresenteerd 17,18. Meest recent, een gids voor de bouw en het gebruik van een enkele kleur twee-beam SIM system werd gepresenteerd met frame rates tot 18 Hz 19,20. De set-up hier gepresenteerde kan SIM superresolutie imaging op 20 Hz in drie kleuren, waarvan er twee worden gebruikt in TIRF-SIM. Het gehele systeem is opgebouwd rond een omgekeerde microscoop frame en gebruikt een gemotoriseerde xy translatietrap met een piëzo-Z platform. De sinusvormige excitatiepatronen vereist TIRF-SIM genereren het gepresenteerde systeem maakt gebruik van een ferroelektrische ruimtelijke lichtmodulator (SLM). Binaire raster patronen worden op de SLM en de resulterende ± 1 ordes van diffractie worden gefiltreerd, geconcentreerd en doorgegeven in de TIR ring van de objectieflens. De noodzakelijke faseverschuivingen en rotaties van de roosters worden aangebracht door het weergegeven beeld SLM veranderen. Dit protocol beschrijft hoe te bouwen en af ​​te stemmen zo&#39;n excitatie pad, worden de uitlijning van de emissie-pad, en presenteert de monsters voor een optimale afstemming. Het ook De<html> schriftgeleerden de problemen en uitdagingen het bijzonder op hoge snelheid TIRF-SIM over polarisatie controle en synchronisatie van componenten. Ontwerp Overwegingen en beperkingen Voor montage van de TIRF SIM-systeem in dit protocol, zijn er verscheidene ontwerpbeperkingen overwegen, die keuze van optische componenten te bepalen. Alle afkortingen van optische componenten zie figuur 1. Ruimtelijke lichtmodulator (SLM) Een binaire ferroelektrische SLM wordt in deze opstelling als het in staat is een milliseconde patroon schakelen is. Grijstinten nematische SLM kan worden gebruikt, maar deze bieden sterk verminderd schakeltijden. Elke in- of uitschakelen pixel in een binaire fase SLM zal verlenen of een π of 0 faseverschuiving om de invallende vlakke golffront, dus als een periodiek raster patroon wordt op de SLM zal werken als een fase-diffraktieraster. ent &quot;&gt; totale interne reflectie (TIR) TIR bereiken en produceren een verdwijnende veld, moet de invalshoek van de excitatie stralen bij de glas-monsterscheidingsvlak groter dan de kritische hoek te <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> . Dit stelt de minimale invalshoek vereist, en dus ook de maximale afstand, of periode van de verdwijnende verlichting patroon. De maximale invalshoek <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> (De acceptatiehoek) wordt beperkt door de numerieke apertuur (NA) van de objectieflens die berekend kan worden uit de definitie <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> . Dit bepaalt de minimale patroon haalbare afstand aan aan de Abbe formule <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> die NA en de golflengte koppelt <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" /> tot het minimum patroon afstand <imgalt = &quot;Vergelijking&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot; /&gt;. In de praktijk, een 1,49 NA olie-immersie objectief TIRF levert een maximale invalshoek van ongeveer 79 ° en een minimale patroonperiode op het monster van 164 nm met een excitatie golflengte van 488 nm. Deze twee hoeken definiëren een ring aan de achterkant apertuur van het objektief waarover het instrument bereikt TIR verlichtingssterkte (dwz. De TIR ring) en waarin de twee brandpunten excitatie nauwkeurig worden gepositioneerd en nauwkeurig geroteerd om elke verlichtingspatroon te genereren. Reconstructie van TIRF-SIM beelden vereist de aankoop van minimaal drie faseverschuivingen per omwenteling patroon daarom de SLM patroon periode moet deelbaar zijn door 3 (zie figuur 1). Bijvoorbeeld, een periode van 9 pixels voor 488 nm belichting en 12 pixels voor 640 nm belichting. Voor een uitgebreide bespreking van de SLM patroon ontwerp, met inbegrip van sub-pixel optimalisatie van de patroon spatiëring gebruiken geschoren roostersZie het eerdere werk van Kner et al. 16 en Lu-Walther et al. 20 De positie van de twee excitatie brandpunten moet in de TIR ring voor alle golflengten, maar de diffractiehoek van de ± 1 orden van de SLM golflengte afhankelijk. Voor standaard SIM kan veelkleurige beeldvormende worden bereikt door het optimaliseren van de rasterperiode van de langste golflengte en tolereren verlies in prestatie voor de korte kanalen. Voor TIRF-SIM echter geoptimaliseerd voor één golflengte betekent dat de andere golflengte brandpunten niet meer onder de TIR ring. Bijvoorbeeld met behulp van een rasterperiode van 9 pixels voldoende is om TIRF voor 488 nm, de foci bij 95% van de diameter van de rug opening binnen het TIR ring, maar 640 nm die periode zouden de brandpunten buitenpositie de opening. Daarom moet verschillen pixelpatroon tussenruimtes worden gebruikt voor elke excitatiegolflengte. De uitlijning van de TIRF-SIM excitatie padextreem gevoelig is voor kleine veranderingen in de positie van de dichroïsche spiegel (DM4 in figuur 1) in de microscoop lichaam, veel meer dan bij conventionele SIM. Gebruik van een roterend filter kubus carrousel wordt niet aanbevolen, in plaats daarvan een enkel multi-band dichroïsche spiegel, die in een vaste positie specifiek voor de excitatie golflengten gebruikte gehouden en gemaakt. Het is essentieel dat alleen de hoogste kwaliteit dichroïsche spiegels worden gebruikt. Deze vereisen dikke substraten van tenminste 3 mm, en worden vaak aangeduid als &quot;platte imaging&quot; door de fabrikanten. Alle andere substraten leiden tot ondraaglijke aberratie en verslechtering van het beeld in TIRF-SIM. polarisatie controle Om TIRF-SIM bereiken moeten de polarisatietoestand van het excitatielicht roteert synchroon met het verlichtingspatroon zodat blijft azimutaal gepolariseerd in de doelstelling pupilvlak ten opzichte van de optische as (dwz. s-gepolariseerde). Aanpassing van de polarisatiecontrole optica zal afhangen van de specifieke optische element gebruikt, bijvoorbeeld een Pockels cel 21, of een halve golfplaat bij een motorisch draaibare fase 22. In dit protocol een custom vloeibaar kristal variabele retarder (LCVR) wordt gebruikt, die full-wave (2π) retardance verschaffen via golflengtegebied 488-640 nm omdat hiermee snel (~ msec) schakelen. Bij gebruik van een vloeibaar kristal retarder is het essentieel om een ​​hoge kwaliteit component: standaardcomponenten zijn meestal niet stabiel genoeg om een ​​constante retardance geven over de lengte van de belichting tijd, die leidt tot dispersie van het verlichtingspatroon en lage modulatie contrast . Vloeibare kristallen vertragers zijn ook sterk afhankelijk van de temperatuur en vereisen ingebouwde temperatuurregeling. Synchronisatie De lasers worden gesynchroniseerd met de SLM. Binaire ferroelektrische SLM intern evenwicht door sbeheksen tussen een op de staatstelevisie en uit staat. De pixels alleen optreden als halve golf platen in zowel hun aan of uit staat, maar niet tijdens de interframe schakeltijd. Daarom de lasers moet alleen worden ingeschakeld in het aan / uit-toestand via de LED activeringssignaal van de SLM een vermindering van patroon tegenstelling voorkomen door het tussenstadium van de pixels. Een akoesto-optische modulator (AOM) kan ook worden gebruikt als een snelle sluiter als de lasers niet digitaal worden gemoduleerd. Keuze van lenzen Op basis van deze beperkingen, de gewenste verkleining van de SLM vlak op het monstervlak om het gewenste verlichtingspatronen kan worden bepaald. Dit maakt de berekening van de focale lengten van de twee lenzen L3 en L4 in het beeld relais telescoop en de excitatie condensorlens L5. In dit systeem wordt een 100X / 1.49NA olie-immersie objectieflens wordt gebruikt bij 488 nm en 640 nm excitatie en gebruikt dus brandpuntsafstand van 300 en 140 mmvoor L4 en L3 en 300 mm voor L5, wat een totaal verkleining van 357x, wat overeenkomt met een SLM pixelgrootte van 38 nm op het monstervlak. Met deze combinatie van lenzen, SLM rasterperiodes van 9 voor 488 nm belichting en 12 pixels voor 640 nm patroon tussenruimte van 172 en 229 nm te geven aan het monster, overeenkomend met invalshoeken van 70 ° en 67 ° respectievelijk. Een glas-water grensvlak, de kritische hoek is 61 °, en is onafhankelijk van de golflengte, dus beide patroon afstanden mogelijk TIRF excitatie voor beide golflengten. Een objectieflens voorzien van een correctie kraag is nuttig voor correctie van sferische aberraties geïntroduceerd door variaties in dikte dekglaasje, of indien deze werkt bij 37 ° C. Beeldreconstructie Zodra ruwe simgegevens is verkregen is een kwestie van rekentijd voor super opgeloste beelden in een tweestapsproces genereren. Enerzijds het verlichtingspatroon te worden bepaaldelke afbeelding en ten tweede moet de componenten van de SIM spectrum worden gescheiden en op geschikte wijze gecombineerd dat een daadwerkelijk OTF drager (zie figuur 6, bijvoegsels) verdubbelen. Precieze kennis van de geprojecteerde verlichtingspatronen het grootste belang, aangezien de super opgelost frequentiecomponenten hebben ongemengde zo nauwkeurig mogelijk artefacten veroorzaakt door de resterende delen van overlappende componenten te voorkomen. We bepalen de verlichtingspatroon parameters a posteriori uit de ruwe beeldgegevens volgens de procedure geïntroduceerd door Gustafsson et al. 23 Kortom, een set van verlichting parameters die een genormaliseerde tweedimensionale sinusoïde beschreven moet worden gevonden voor elk van de <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" /> excitatiepatronen <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> : <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" /> Hierbij <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> en <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" /> beschrijven de pony contrast en het patroon respectievelijk startfase van elke individuele afbeelding m. De componenten van de golfvector, <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" /> en <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> , Alleen veranderen met de verschillende oriëntaties <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" /> van de patroon en kan overigens gelijkblijvende verondersteld te zijn. Om grof bepalen van de componenten van de golf vector een kruiscorrelatie ruwe beeld spectra wordt uitgevoerd, wordt geraffineerd door toepassing subpixel verschuift naar een van de kruis-gecorreleerde beelden om de overlap te optimaliseren. Dit gebeurt via vermenigvuldiging van real-space fase gradiënten <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" /> dat leiden tot een subpixel verschuiving in frefrequentie-ruimte. Merk op dat het nuttig is om een ​​goede schatting van de golf-vectoren voorafgaand af van de exacte schatting patroon en dit kan worden gevonden door het afbeelden van een fluorescerende laag bead. Aangezien de fase stap tussen verschoven patronen is <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> , Dwz. <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> De scheiding van frequentiecomponenten kan worden uitgevoerd door een Fourier-transformatie langs de &quot;fase-as&quot;. De wereldwijde fase <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" /> en de pony contrast <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> kan dan worden bepaald met behulp van complexe lineaire regressie van verschillende componenten. De afzonderlijke componenten gescheiden worden dan gecombineerd met een gegeneraliseerde Wiener filter. Voor een gedetailleerde beschrijving van zowel de parameter extractie en de uitvoering van de algemene Wiener filter verwijzen we de lezer naar Gustafssonet al. 23 waarbij hetzelfde algoritme wordt gebruikt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1149">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Toptica</td>
			<td style="width:181px;">iBeam SMART</td>
			<td style="width:535px;">with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Coherent</td>
			<td style="width:181px;">OBIS LS</td>
			<td>with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">640 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Cobolt</td>
			<td style="width:181px;">MLD</td>
			<td>with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Long-pass dichroic mirrors&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td>for combining excitation beams</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Quad band dichroic mirror</td>
			<td style="width:143px;">Chroma</td>
			<td style="width:181px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Quad band dichroic mirror</td>
			<td style="width:143px;">Chroma</td>
			<td style="width:181px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>From same batch as above, 25 x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">1&#34; square kinematic mount</td>
			<td style="width:143px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:181px;">58-860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glan-Taylor calcite polarizers</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">GT5-A</td>
			<td>For alignment of LCVR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glan-Taylor mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SM05PM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Achromatic half wave plate</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AHWP05M-600</td>
			<td>400 - 800 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1/M</td>
			<td>For HWP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Liquid Crystal Variable Retarder</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">SWIFT</td>
			<td>Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">LCVR controller</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">D3060HV</td>
			<td>Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Achromatic quarter wave plate</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">AQM-100-0545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1P/M</td>
			<td>For QWP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">10 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC080-010-A-ML</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">200 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Cage XY Translators</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Ferroelectric spatial light modulator</td>
			<td style="width:143px;">Forth Dimension Displays</td>
			<td style="width:181px;">M0787-00249&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">SLM mounting frame</td>
			<td style="width:143px;">Forth Dimension Displays</td>
			<td style="width:181px;">M0787-10014</td>
			<td>Fixed to custom built aluminium mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">&#216;50.8 mm Gimbal Mirror Mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">GM200/M</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">XYR1/M</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rail carrier</td>
			<td style="width:143px;">Newport</td>
			<td style="width:181px;">M-PRC-3</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Precision Optical Rail</td>
			<td style="width:143px;">Newport</td>
			<td style="width:181px;">PRL-6</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">300 mm achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:143px;">Qioptiq</td>
			<td style="width:181px;">G322 273 322&#160;</td>
			<td>f = 300 mm, 31.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">140 mm achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:143px;">Qioptiq</td>
			<td style="width:181px;">G322 239 322</td>
			<td>f = 140 mm, 31.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Precision XY Translation Mounts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">LM2XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Lens Mounting Adapters</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SM2AD32</td>
			<td>For mounting 31.5 mm lenses in 2&#34; mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Translation stages</td>
			<td style="width:143px;">Comar</td>
			<td style="width:181px;">12XT65</td>
			<td>Dovetail, side drive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">XY Translator with Differential Drives</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">ST1XY-D/M</td>
			<td>for spatial filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1/M</td>
			<td>for spatial filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">300 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC508-300-A-ML</td>
			<td>Excitation tube lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Automated XY stage with Z-piezo top plate</td>
			<td style="width:143px;">ASI</td>
			<td style="width:181px;">PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&#160;</td>
			<td>with MS-2000 controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Inverted microscope frame</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">IX-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Objective lens</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">UAPON100XOTIRF</td>
			<td>100X/1.49NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">High speed filter wheel</td>
			<td style="width:143px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:181px;">HF110A</td>
			<td>with Prior ProScan III controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bandpass emission filters</td>
			<td style="width:143px;">Semrock</td>
			<td style="width:181px;">FF01-525/30, FF01-676/29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:143px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:181px;">ORCA Flash v4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Stage top incubator</td>
			<td style="width:143px;">OKO Lab</td>
			<td style="width:181px;">H301-K-FRAME</td>
			<td>For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Stainless steel optical posts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">TR series</td>
			<td>for mounting optical components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Post holders</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">PH series</td>
			<td>for mounting optical components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Kinematic mirror mounts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">KM100</td>
			<td>for mounting 1&#34; mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">100 nm fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">T-7279</td>
			<td>Tetraspeck</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">83697-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">8 well glass bottom dishes</td>
			<td style="width:143px;">ibidi</td>
			<td style="width:181px;">80827</td>
			<td>with #1.5 coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">155409</td>
			<td>with #1.5 coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">0.01mm microscope reticle slide</td>
			<td style="width:143px;">EMS</td>
			<td style="width:181px;">68039-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">C10613</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to structured illumination tirf microscopy at high speed with multiple colors

Optische super-resolutie beeldvorming met gestructureerde verlichting microscopie (SIM) is een belangrijke technologie voor de visualisatie van processen op moleculair niveau in de chemische en biomedische wetenschappen. Hoewel commerciële SIM systemen zijn systemen die op maat zijn ontworpen in het laboratorium commerciële systemen beter presteren dan deze eigenlijk ontworpen voor gebruiksgemak en algemene toepassingen, zowel qua beeldvorming betrouwbaarheid en snelheid. Dit artikel geeft een uitgebreide gids voor het opbouwen van een SIM dat gebruik maakt totale interne reflectie (TIR) ​​verlichting en kan imaging up to 10 Hz in drie kleuren met een resolutie van 100 nm. Door de combinatie van SIM en TIRF, het systeem beter beeldcontrast dan concurrerende technologieën. Om deze specificaties te bereiken worden verschillende optische elementen die gebruikt worden om automatische controle over de polarisatietoestand en de ruimtelijke structuur van de verlichting licht mogelijk te maken voor alle beschikbare excitatie wavelengths. Volledige details over de hardware-implementatie en controle worden gegeven aan synchronisatie tussen excitatielicht patroon generatie, golflengte, polarisatie staat, en de camera controle te bereiken met de nadruk op het bereiken van maximale overname frame rate. Een stap-voor-stap protocol voor het systeem uitlijnen en kalibratie wordt gepresenteerd en de haalbare verbetering resolutie gevalideerd op ideale testmonsters. De mogelijkheid om video-rate super-resolutie beeldvorming wordt gedemonstreerd met levende cellen.

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors at JoVE.com

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopie op hoge snelheid met meerdere kleuren

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

The overall goal of this protocol is to construct and align a structured illumination microscope suitable for high speed live cell super resolution imaging capable of operating in TIRF and optical sectioning modes with multiple colors. This method can help answer key questions in the field of cell biology that cannot currently be answered using standard diffraction limited TIRF microscopy. The main advantage of this technique is its fast time resolution compared to other super resolution microscopy techniques, which make it well suited to imaging dynamic processes in living cells.Though this protocol describes the steps for construction of a TIRF-SIM microscope, the setup is flexible and easily modified to implement imaging modalities such 3D-SIM, multifocal SIM, and non-linear SIM. To arrange and align the excitation path for a structured illumination microscope, begin by marking the positions of the components on the optical table as indicated here. After inserting the first dichroic mirror, DM4, into the filter cube turret of the microscope frame, insert the second dichroic mirror, DM3, into a one inch square kinematic mirror mount and position it one focal length away from the condenser lens, L5.Next, to accurately define the optical access for the system, remove the objective lens, OB, from the turret, and instead screw in an alignment tool.Then, use the dichroic mirror DM3 and a temporary alignment mirror positioned at the approximate ultimate location of the SLM to steer a collimated reference beam from laser one through the center of the holes in the two alignment disks. Using three mirrors and dichroic mirror DM2 as depicted here, direct the beam from laser one to the temporary mirror. Once the coarse optical axis has been determined, remove the alignment tool.Then insert an iris into the beam path before it enters the microscope body and center it on the beam. Attach a piece of white card with a small hole centered on the iris, then reinsert the objective lens. Next, make iterative angular adjustments to the mirrors DM3, and at the SLM position to center the back reflection on the card with the incoming beam.Then temporarily remove the objective lens and mark the laser spot on the ceiling to create a reference position. Insert the tube lens, L5, roughly one focal length away from the objective, mounting it on a linear translation stage set to translate along the direction of the reference beam. Adjust the tube lens position and angle such that the beam leaving the objective is collimated and hits the reference spot on the ceiling.Check that the lens is perpendicular to the beam by again checking the back reflection with the iris and white card. Then remove the objective lens and insert the second lens of the image relay telescope, L4.Use the linear translation stage to adjust the position and angle of this lens to maintain collimation, and to ensure the reference beam still hits the marked spot on the ceiling. Replace the objective lens and insert the first lens of the telescope, L3.Adjust the position and angle of this lens to ensure collimation and non-deflection as described earlier.After mounting the SLM chip according to the text protocol, with the lenses aligned, insert the SLM in place of the mirror. Adjust the position of the SLM such that the reference beam is located at the center of the SLM chip, and adjust the angle so that the beam passes through the two relay lenses. Then check that the reference beam is still centered on the marked spot.Mount the liquid crystal variable retarder, or LCVR, with its fast axis at 45 degrees to the incident polarization. Then after completing the alignment of the polarization rotator according to the text protocol, using transmitted light through the oculars, focus on a reticle and fix the objective lens at this position. Then prepare a monolayer of fluorescent beads by spreading a drop of 100 nanometer multicolor beads on a number 1.5 coverglass.Leave the beads to dry to adsorb the beads to the glass before re-immersing in water. Using immersion oil, place the bead sample onto the objective. Finely adjust the position of the camera so that the fluorescent bead layer is in focus.After generating SIM binary grating patterns as bitmap files and uploading them to the SLM according to the text protocol, load the SLM control software and click Connect. In the Repertoire"tab, click Load"to open the repertoire file, and check the number of running orders contained in the file. Click Send to Board"to upload the repertoire file to the SLM.Next, select the Status"tab and enter the number of the running order. Click Select"to change the running order to the alignment grating. Insert a spatial mask, or SM, mounted on an XY stage into the beam path at the focal position of L3, and translate its position with respect to the optical axis such that only the desired first orders are passed.Directly after the spatial filter, only two circular beams will be visible. Check the image of the fluorescent bead layer on the camera. If the two circular beams are not overlapping as depicted here, then reposition the sample plane, iteratively adjusting the objective lens and camera position.After fine tuning the focus and setting the sample plane according to the text protocol, confirm TIRF illumination by imaging, for example, a solution of 10 micromolar rhodamine 6G dye by bringing the dye into focus. If the two beams are incident at the correct TIRF angle, then single molecules will be visible without high background, and the edges of the circular aperture will be in focus. Fine adjustments to the position of the beams can be made by adjusting dichroic mirror DM3.To synchronize and calibrate the system, place the bead monolayer sample on the objective, and bring into focus. Use the SLM control software to program the SLM to display each of the three phase shift images in turn for the first pattern orientation. Then switch to running order four of the example repertoire.In the acquisition software, configure the camera for the global exposure period by choosing Advanced Camera Properties"and setting Output Trigger Kind 1"to positive, and Output Trigger Kind 2"to negative. In the sequence pane under Scan Type, select Hard Disk Record, and set the frame count to three. Then click Start"to acquire three frames.The SLM pattern will change upon each exposure. After callibrating the system according to the text protocol, in the SLM control software, switch the SLM running order to the full series of nine binary grating images required for TIRF-SIM. This is running order zero in the example repertoire.After acquiring nine images of the bead sample, in the sequence pane of the camera software, select Hard Disk Record"as the scan type, and change the frame count to nine. Then click Start"to acquire images. Finally, under Save Buffered Images, choose TIFF as the image type, and click OK.Reconstruct a super resolution image according to the text protocol.Shown here, multicolor 100 nanometer diameter fluorescent beads were imaged to compare standard TIRF to TIRF-SIM. TIRF-SIM clearly had significantly higher lateral resolution compared to TIRF. The estimated resolution of the microscope is 90 nanometers and 120 nanometers for 488 and 640 nanometer TIRF-SIM, respectively.This corresponds to a two fold improvement in lateral resolution for both wavelengths compared to the theoretical diffraction limited case. As seen here, fluorescently labeled amyloid fibrils were formed in vitro and also used as a test sample for demonstrating doubled resolution. Sub-cellular structures with high contrast, such as emGFP labeled microtubules or LifeAct-GFP are ideal for TIRF-SIM imaging, and yield high contrast, super resolution images.TIRF-SIM imaging using the demonstrated setup enables observation of a subpopulation of microtubules located in the vicinity of the basal cell cortex, and microtubule polymerization and depolymerization can be seen over time. Low contrast samples without discrete structures lack high resolution information except at the edges of the plasma membrane, and are hence suboptimal for TIRF-SIM imaging. Finally, high modulation contrast is essential for successful SIM imaging.As demonstrating here, the Fourier transform of the reconstructed image allows visualization of the SIM optical transfer function. Once mastered, this technique can be completed in around one week, if all the necessary parts have been acquired. When attempting this procedure, one must be aware of the most critical issues for successfully implementing TIRF-SIM.First, precise alignment of the beams is essential. This can be difficult, as they must be located at the edges of the objective lens aperture. Secondly, it is critical that the polarization state of the light is co-rotated with the pattern.Without this, the pattern contrast of the sample will be low and subsequent image construction will be impossible. After watching this video, you should have a good understanding of the most important steps in the construction and alignment of an SLM based, TIRF-SIM microscope. Don't forget that working with Class 3B lasers can be extremely hazardous.The laser power must be kept at eye safe levels whilst performing the alignment process with the TIRF objective in place.