Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.
Es besteht ein dringender Bedarf zu entdecken, und die Fortschritte Antiinfektiva, die die Dauer der Tuberkulose (TB) Behandlung zu verkürzen. Mycobacterium tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose, ist resistent gegen rasche und dauerhafte Chemotherapie aufgrund der Anwesenheit von Bazillen phänotypische Medikamentenresistenz aufweisen. Die c harcoal ein GAR r esazurin eine ssay (CARA) wurde als ein Werkzeug entwickelt , aktive Moleküle durch Hochdurchsatz - Screening - Kampagnen gegen die Replikation und nicht-replizierende M. tuberculosis entdeckt zu charakterisieren. Die Aufnahme von Aktivkohle in bakteriologischer Agar-Medium hilft, die Auswirkungen der Verbindung Übertrag zu mindern, und beseitigt die Erfordernis Zellen auf CARA Mikrotiterplatten vor Spek vorab verdünnen. Nach einer 7-10 Tage Inkubationsdauer bei 37 ° C ermöglicht die Reduktion von Resazurin durch mykobakterielle Mikrokolonien auf der Oberfläche der CARA Mikrotitervertiefungen wachsenden semi-quantitative assessment von Bakterienzahlen über Fluorometrie. Die CARA erkennt etwa eine 2-3 log 10 Unterschied in der Bakterienzahlen und prognostiziert eine minimale bakterizide Konzentration führt zu ≥99% Bakterienabtötung (MBC ≥99). Die CARA hilft festzustellen, ob ein Molekül auf Bazillen aktiv ist, die, nicht replizierenden oder beide zu replizieren. Pilotversuche die CARA mit erleichtern die Identifizierung von denen Konzentration der Testmittel und die Zeit der Verbindung Exposition erfordern weitere Auswertung von koloniebildende Einheit (CFU) Assays. Darüber hinaus kann die CARA vorhersagen, ob die Replikation Wirkstoffe bakterizide bzw. bakteriostatische sind.
Mycobacterium tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose, kann in einem Wirt in einem latenten Zustand überleben, die Antibiotika - Ausrottung resistent ist. Phänotypische (nicht-genetischen) Widerstand von M. tuberculosis während der Infektion wird angenommen , daß dies zu sein, teilweise , um Populationen von nicht-replizierende Bazillen 1,2. Klasse I persisters phänotypische Medikamentenresistenz unter großen Populationen von Drogenempfindlichen Zellen 3,4 entstehen über seltene stochastischen Mechanismen anzeigt. Klasse II persisters sind nicht replizierenden durch Faktoren der Wirtsimmunität gemacht, einschließlich der externen Belastungen in Mikroumgebungen während der Infektion auftreten. Kürzlich entwickelten wir ein in - vitro - Modell der Klasse II nicht replizierenden Persistenz Bedingungen von M. tuberculosis in aktivierten Makrophagen und Granulome konfrontiert zu imitieren. Die Multi-Belastungsmodell der Klasse II Persistenz umfasst Bedingungen, dass ein langsames Wachstum, wie beispielsweise einer Fettsäure Kohlenstoffquelle und vollständig halt Wachstum, wie milde Säure (pH 5,0), Hypoxie (1% O 2) und Stickoxid und andere reaktive Stickstoffzwischenprodukte 5-9. Groß angelegte Screening dieses Multi-Stress - Modell von nicht-Replikation verwendet wird , und andere Klasse II nicht replizierenden Modelle hat diverse Moleküle ergeben , deren Aktivität gegenüber dem nicht-replizierenden Zustand gerichtet ist 5-7,9-18. Die gleichen nicht-replizierenden Bildschirme zeigte auch eine Kategorie von Molekülen , die sowohl replizierende und nicht-replizierende Bazillen Aktivität gegen besitzen, als "dual Aktiv" 7,10,12,19,20.
Antibakteriell Wirkstoffforschung in der Treffer-to-Lead - Phase beinhaltet umfassende Charakterisierung von Kandidatenmolekülen führt zur Treffer Expansion, vorläufige pharmakologische Charakterisierung, Zielidentifizierung und vorläufige Wirksamkeit in vivo Studien zur Auswahl. Als erster Schritt werden Antiinfektiva durch ihre bakteriostatische oder bakterizide Wirkmechanismus klassifiziert und, wenn bakterizid, whether Bakterienabtötung ist zeit- und / oder konzentrationsabhängig. Die Kolonie bildende Einheit (CFU) Assay ist die klassische, Goldstandard Methode, um diese Fragen zu beantworten. In der CFU-Assay werden die Bakterien auf einem Testmittel ausgesetzt, wonach Aliquots entfernt werden, seriell verdünnt, und Aliquots der Verdünnungen werden auf festen bakteriologischen Medium verteilt und inkubiert Wachstum der überlebenden Zellen zu ermöglichen. Schließlich werden Bakterienkolonien gezählt. Die CFU-Test erfordert eine große Anzahl von Mikrotiterplatten Zellen und Agar enthaltenden Petriplatten zu verdünnen überlebenden Kolonien aufzuzählen. Die CFU-Assay für langsam wachsende Mykobakterien durch ihre langsame Generationszeit (18-24 Stunden) behindert, die etwa 3 Wochen erfordert für Kolonien auf Platten zu erscheinen. Darüber hinaus wird Inkubator Raum oft in spezialisierten Biosicherheit-Level-3-Anlagen beschränkt.
Während umständlich, CFU-Assays sind der Goldstandard, die Auswirkungen von nicht-replizierenden und Dual-aktive Moleküle auf mycobacter zu charakterisierenia. Nicht-replizierende Assays unterliegen hohen Fehlalarmquote , so viele sind mit Assays replizierende zelluläre Lebensfähigkeit 6-8 zu bewerten. Zum Beispiel kann eine Verbindung , die eine starke Aktivität gegen replizierende M. tuberculosis (ein "Replizieren aktiv") kann fehlschlagen , während der nicht-replizierenden Assay zu töten, kann aber aufgrund der Übertrag von der nicht-replizierenden Phase des noch töten Test auf der Erholungsphase des Assays, die unter Bedingungen durchgeführt wird, die Replikation ( "replizieren von Bedingungen") zu unterstützen. Verbindung tragen über erschwert die weitere Analyse der dualen aktiven Molekülen, so dass es schwierig zu unterscheiden, ob Aktivität zu replizieren, nicht replizierenden oder Dual.
Um die Probleme anzugehen oben beschrieben, entwickelten wir das c harcoal ein GAR r eine ssay (CARA) für eine schnelle, semi-quantitative Zählung von mycobakteriellen Spezies, wie M. tubercul esazurinosis, M. bovis BCG und M. smegmatis 7 (1 und 2). In Pufferlösungen in vitro, Aktivkohle sequesters schnell die meisten Standard Drogen verwendet , um Tuberkulose 7 zu behandeln. Aktivkohle in CARA Mikrotiterplatten bindet Verbindungen , die aus einem Assay Mikrotiterplatten - Übertrag kann, und dieses Merkmal der CARA eliminiert die Anforderung zu seriell Assay gut Inhalt vor der Zählung 7,21,22 verdünnen. Die Anzahl der mykobakteriellen Mikrokolonien auf der Agar - Oberfläche von CARA Mikrotiterplatten durch Zugabe von Resazurin geschätzt wird, einen blauen Farbstoff, dessen reduzierte Form, Resorufin, ist ein rosa Molekül , dessen Fluoreszenz durch Spektrophotometrie 23 gemessen wird. CARA Mikrotiterplatten für 1-2 Tage inkubiert werden für M. smegmatis und 7-10 Tage für langsam wachsende Mycobakterien wie M. tuberculosis und M. bovis BCG. Die CARA hat einen schmalen Dynamikbereich von ~ 2-3 log 10 verschierenz in CFU. Wenn anstelle eines CFU-Assay verwendet wird, ersetzt eine einzige CARA Mikrotiterplatte etwa fünf 96-Well-Platten für serielle Verdünnungen verwendet, und 120 tri-Stil für das Plattieren verwendet Agarplatten. Die Interpretation der CARA Daten hilft nachfolgende Studien führen, durch die Inkubationszeiten und Konzentrationen der Verbindung zu testen, in mühsamer CFU-basierte Assays zu bestimmen.
1. Herstellung von CARA Mikrotiterplatten
2. Einrichten von Replizieren und nicht-replizierende MIC 90 Assays
3. Inokulation von CARA Mikrotiterplatten
4. Entwicklung von CARA Micro
5. Datenanalyse
Antizipierte CARA Ergebnisse sind in Figur 2 und in Tabelle 1 zusammengefasst beschrieben. Für Zellen replizieren, wird die CARA parallel zu einem Standard - MIC 90 Tests laufen, und für nicht-replizierende Assays wird die CARA parallel mit einem angepassten MIC 90 - Test ausführen, die ein Auswuchs Phase gekoppelt ist. Die Konzentration der Testmittel , das in Ausfall von CARA-Fluoreszenz führt über Hintergrundgehalte steigen die CARA-MBC ≥99 (Abbildung 3a). Die "≥99" Index zeigt an, dass die CARA-MBC eine geschätzte Konzentration des Testmittels liefert, die zu ≥2 log 10 Bakterienabtötung (≥99% kill) gibt.
Die flüssige Nährlösung MIC 90 - Test ist nicht in der Lage zwischen bakterizide und bakteriostatische Aktivität zu unterscheiden und diese Unterscheidung ist von einem CFU - Assay gelöst werden. DurchKonvention, die Schwelle , die für langsam wachsende Mykobakterien ist etwa 2-3 log 10 Kill über 7 Tage 7,26 bakterizide von bakteriostatische Aktivität unterscheidet. Da der Dynamikbereich des CARA auch töten 2-3 log 10 ist, kann die CARA eine Schätzung der bakterizide oder bakteriostatische Aktivität liefern. Die CARA identifiziert leicht einige replizierende Wirkstoffe als bakteriostatisch durch den Ausfall dieser Verbindungen CARA Fluoreszenz zu Hintergrundwerten (Abbildung 2) zu verringern. Allerdings haben einige Verbindungen mit bakteriostatischen Aktivität gegen replizierende M. tuberculosis eine starke Post-Antibiotika - Wirkung, was bedeutet , dass sie auch weiterhin während der Erholungsphase auch in Abwesenheit der Verbindung carry-over Nachwachsen von Bakterien zu hemmen. Dieser Effekt kann schwierig sein, in der CARA-Assay zu erkennen. Die Verbindungen werden im Verdacht, eine post-antibiotische Wirkung ausüben, wenn sie einen "statischen Fenster" angezeigt werden, definiert als> 4-fache Verschiebung nach rechts between die MIC und CARA - Kurven (Abbildung 3b). Das statische Fenster zeigt an, dass ein Molekül , aktiv gegen die Replikation von M. tuberculosis bakteriostatisch sein kann anstelle der bakteriziden. In einigen Fällen sind die statischen Fenster offensichtlich nur nach Überprüfung eines erweiterten Y-Achse für CARA Fluoreszenz (3c und 3d).
CARA und MIC 90 Daten werden in der Regel zusammen aufgetragen (Abbildung 4). Repräsentative Daten für replicating- und nicht-replizierende aktiven Moleküle durch MIC getestet 90 und CARA sind in Abbildung 4 dargestellt. Es gibt vier Hauptaktivitätsklassen für Moleküle: 1) replizierende bakterizid (gezeigt mit Isoniazid, 4a); 2) Replizieren bakteriostatische (gezeigt mit Linezolid, 4b); 3) nicht-replizierenden bakterizid (gezeigt mit Oxyphenbutazon, 4c); und 4) replicating aktive (bakteriostatisch oder bakterizid) und nicht-replizierende bakterizid (gezeigt mit PA-824, 4d). Wichtig ist , Figuren 4a und 4b zeigen , dass während Isoniazid und Linezolid angezeigt durch den MIC 90 - Assay Aktivität gegen nicht-replizierenden Bakterien zu haben, das CARA schlägt sie unter den nicht-replizierenden Bedingungen getestet inaktiv sind. Die Nützlichkeit der CARA Um zu testen , die in einem Molekül der zeit- und konzentrationsabhängige Wirkung der Vorhersage, M. smegmatis replizieren ausgesetzt war Konzentrationen von Rifampicin (5a - d) zu erhöhen und zu verschiedenen Zeiten zwischen 24.01 h wurden Aliquots getupft auf CARA Platten. Diese Daten zeigten , dass Rifampicin einen Einfluss ausgeübt bereits 1 h (5a) angezeigt Erhöhung bakterizide Aktivität zwischen 3 und 24 h (Figuren 5b-d) und getötet ≥2-3 log 10 bei ~ 10 & mgr; g / ml nach 24 h (5d). Ein ähnliches Experiment testet vierfach eines Fahrzeugsteuerung und 9 Arzneimittelkonzentrationen und bei 4 Zeitpunkte, würde durch einen Standard CFU-basierten Assay prohibitiv sein.
Somit hat die CARA eine Rolle in der Wirkstoffforschung als Medium-Throughput, schnellen Mechanismus eines Moleküls Aktivitätsprofil zu identifizieren. CARA Prognosen rigoros werden sollte mit einem Standard-CFU-Test bewertet. Die Zugabe von 0,4% Aktivkohle auf Petri - Platten für CFU - Analyse helfen Korrelation zu CARA Daten verbessern kann, und in genaueren CFU Zählungen führen können, im allgemeinen die Größe der Korrektur zu der Verbindung Potenz 21,22 proportional ist.
Abbildung 1: Die CARA ist eine prädiktive Werkzeug in der Wirkstoffforschung. Dieses Diagramm fasst den Nutzen der CARA alsZwischenstufe zwischen Wirkstoff-Screening (Single-Point-Screening, Rosinenpicken und Dosis-Wirkungs-Assays) und zeitraubend Hit-to-Lead-Assays (CFU-Assays und Zielidentifizierung). [Adaptiert mit Erlaubnis von Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Brühe MIC 90 - Assay und CARA mit erwarteten Ergebnissen. Beide MIC 90 und CARA Ergebnisse werden für die 8 möglichen Aktivitäten vorgestellt. Die Farbcodierung für MIC 90 Mikrotitervertiefungen ist weiß (kein Wachstum) und braun (Wachstum) und für CARA Mikrotiterplatten ist schwarz (keine Fluoreszenz) und Rosa (Resorufin Fluoreszenz). Die Daten sind hypothetisch. [Adaptiert mit Erlaubnis von Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Specialized CARA Begriffe und Definitionen. Die Minimale bakterizide Konzentration eines Moleküls , was zu Hintergrundwerten von CARA Fluoreszenz ist das CARA-MBC ≥99 (a). Unter Replizieren Bedingungen zeigt eine ≥4 fache Verschiebung der CARA-MBC ≥99 nach rechts des MIC 90 oft bakteriostatische Aktivität und ist ein "statisches Fenster" (b) bezeichnet. Bei Molekülen mit einem potenten post-antibiotische Wirkung kann statische Fenster schwierig sein, (c) beobachten und erfordernExpansion der Y-Achse (CARA Fluoreszenz) sichtbar zu machen (d). Die Daten sind hypothetisch. [Adaptiert mit Erlaubnis von Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Illustrative MIC 90 und CARA - Ergebnisse für ausgewählte Verbindungen. Daten für MIC 90 (rot) und CARA (blau) für (a) Isoniazid (INH), (b) Linezolid, (c) Oxyphenbutazon gezeigt, und (d) PA-824. Wildtyp M. tuberculosis H37Rv wurde 7 Tage unter Standard replizierenden Bedingungen oder der Multi-Stress - Modell von Nicht-Replikation 7-9 Verbindungen ausgesetzt. MIC 90 - Assays und CARA wurden wie in Abbildung 2 gezeigt , durchgeführt. [Adaptiert mit Erlaubnis von Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 20157]Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: dosis- und zeitabhängige Aktivität von Rifampicin. Der nicht-pathogene, schnell wachsende M. smegmatis wurde bei Konzentrationen von Rifampicin ausgesetzt unter Bedingungen zu replizieren , und Aliquote wurden zur Steigerung der 1 (a) für CARA abgetastet, 3 (b), 6 (c) und 24 (d) hr. [Adaptiert mit Erlaubnis von Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7].com / files / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Zusammenfassung der erwarteten Ergebnisse in Abbildung 2. [Adaptiert mit Erlaubnis von Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Die CARA wurde ursprünglich entwickelt , 7 einen Engpass in voran nicht replizierenden oder Dual-aktive Moleküle zu lindern. Das CARA dient als Zwischenschritt zwischen Konzentrations-Wirkungs - Bestätigung von primären Screening - Hits und CFU - Assays (Abbildung 1). Da eine einzelne CARA Platte zahlreiche Mikrotiterplatten erforderlich ersetzen kann, um serielle Verdünnungen herzustellen und Agar-haltigen Platten Petri verwendet überlebenden Bakterien aufzuzählen, stellt die CARA ein einfaches Mittel, um schnell zu einem Molekül der Aktivität zu bewerten und mehrere Variablen auf einmal zu testen, einschließlich Verbindungskonzentration und die Zeit der Exposition gegenüber der Verbindung.
In einem CFU - Assay, zusätzlich zur seriellen Verdünnungen, die 10 6 -fach Bereich bis oft die Agarplatte verdünnt typischerweise Moleküle durch eine zusätzliche ~ 800-fachen (10 & mgr; l auf 8 ml in einem tri-Petriplatte). Unsere zweistufigen, Multi-Stress Screening - Test für Verbindungen , die aktiv auf nicht-replizierenden M. tuberkulose hat einen Übertrag Faktor 5-fach, dh eine Verbindung , die in der nicht-replizierende Stufe des Assays auf ein Fünftel der ursprünglichen Konzentration in dem Auswuchs (Replizieren) Phase des Assays 6-9 vorhanden ist. Die CARA mildert Carry-Over-Effekte durch kleine Moleküle mit Aktivkohle zu maskieren. Die Mehrzahl der tuberculosis Medikamente und klinische Kandidaten binden Kohle schnell aktiviert und vollständig, mit Ausnahme der Aminoglykosid Streptomycin 7. Die Aufnahme von Aktivkohle in Agarplatten für CFU - Assays bakterielle Wachstumshemmung verhindert oder Bakterienabtötung durch übertragene TMC207 und PA-824 7,21,22. Somit aufgrund von Aktivkohle in der bakteriologischen Agar enthält, ist das CARA nicht abhängig von seriellen Verdünnungen von Zellen und Testmittel.
Die CARA kann bakteriostatische oder bakterizide Wirkung von replizierenden Wirkstoffe und bakterizide Wirkung von nicht-replizierenden Wirkstoffe helfen vorherzusagen. in general, die CARA ist parallel mit Standard - MIC 90 - Assays verwendet. Die Vorhersagekraft des CARA kommt aus dem Vergleich MIC 90 und CARA Ergebnisse (Abbildung 2 und Tabelle 1). Bei der Verwendung zur antimykobakteriellen Mittel studieren, kann die CARA genau Aktivität vorhersagen , die bakterizid (4a) repliziert wird , replizieren bakteriostatisch (Abbildung 4b), nicht-replizierenden bakterizid (4c) oder Dual - aktiv (4d). Die CARA erlaubt auch eine einfache Auswertung der Tätigkeit eines Verbindung über beide Dosis und Zeit. CFU - Assays erfordern allein viel Aufwand und Material Aktivität einer Verbindung über einen weiten Bereich von Dosierungen und Zeiten zu beurteilen, aber die Aufgabe wird überschaubar , wenn CARA Ergebnisse den Bereich von Bedingungen, wie sie verengen , in denen die Verbindung nachweislich aktiv ist (Abbildung 5 ).
Während die CARA hat Dienstprogramm, um die Wirkung eines in das StudiumNTI-infectives auf Mykobakterien, hat der Test Einschränkungen. Das CARA hat einen schmalen Dynamikbereich (2-3 log 10) und kann für Bedingungen , unter denen man erwartet , es nicht geeignet sein, nicht mehr als 2 bis 3 log 10 Bakterienabtötung ist. CARA Prognosen erfordern weitere Studie eine strengere und genaue Methode zur Bakterienzahlen, wie eine CFU-Assay aufzuzählen. Die post-antibiotische Wirkung einiger Antiinfektiva, wie PAS, die CARA als prädiktiver Werkzeug zwischen den Verbindungen mit bakterizide und bakteriostatische Wirkung gegen replizierende M. tuberculosis 7 zu unterscheiden verwechseln.
Es gibt zwei Empfehlungen, die Qualität der CARA zu verbessern. Zuerst muss man CARA gießen Mikrotiterplatten schnell vor den Agar sich verfestigt, während die volumetrische Genauigkeit beibehalten und außerhalb von Mikrotitervertiefungen Spritzwasser zu vermeiden. Unabhängig von der Anzahl von Platten erforderlich ist, empfehlen wir, 0,5 bis 1 L Chargen des Mediums, um die m aufrechtzuerhaltenedium in flüssiger Form für die Dauer der Zeitplatten zu gießen erforderlich. Ändern Spitzen häufig während mit mittlerer Füllung Mikrotiterplatten vermeidet teilweise verstopft Tipps. Zweitens muss eine artifactual Variabilität in der Fluoreszenz zwischen den Replikaten minimieren. Mykobakteriellen Mikrokolonien, insbesondere für pathogene Mycobakterien wie M. tuberculosis, wachsen häufig erratisch. Zum Beispiel können Mikrokolonien auf der Agaroberfläche wachsen variieren in Größe, Form, Höhe oder kann an den Innenwänden der Mikrotitervertiefungen erstrecken. Eine Herausforderung ist es, alle Bazillen gleichmäßig mit dem Entwicklungs Reagenz zu decken. Eine weitere Hürde ist, dass nach einer längeren Inkubation bei 37 ° C, der Feststoff bakteriologischen Medium der CARA Mikrotiterplatten trocken werden können und anfällig für die Entwicklung von Reagenz absorbiert. Da Aktivkohle binden Resazurin und löschen Fluoreszenz 7, kann es zu trockenen Brunnen durch gut-zu-gut Variante sein , die Resazurin Entwicklungslösung zu absorbieren und die aktivierte Charcoal Abschrecken Resazurin Fluoreszenz. Vorbenetzung sofort die Oberfläche aller CARA Mikrotitervertiefungen mit PBS vor dem Entwicklungs Reagenz Zugabe mildert diese beiden Probleme - das Entwicklungsreagens alle mykobakteriellen Kolonien gleichermaßen zu erreichen, und das Resazurin bleibt sicher oberhalb der Aktivkohle. Die CARA kann Anwendungen bei der Identifizierung und Phänotypen von Mykobakterien-Mutanten oder in mittlerem Durchsatz Drug Discovery-Assays für andere Bakterienarten zu charakterisieren.
Es gibt keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Wir sind dankbar, dass Kristin Burns-Huang-für Expertensicht des Manuskripts und J. David Warren (Weill Cornell Medical College) für die Unterstützung der Chemie, während die CARA entwickeln. Diese Arbeit wurde von der TB Drug-Accelerator-Programm von der Bill und Melinda Gates-Stiftung, die Abby und Howard P. Milstein Programm in Translational Medicine, und ein NIH TB Research Unit (U19 AI111143) unterstützt. Die Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie wird durch die William Randolph Hearst Foundation unterstützt. SSK wurde von NIH Zuschusses K08AI108799 unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
BSA, heat shock | Roche | 3118958001 | |
activated charcoal | Sigma | C5510 | |
PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
tween 80 | Sigma | P8074 | |
tyloxapol | Sigma | T8761 | |
sodium nitrite | Sigma | 2252 | |
rifampicin | Sigma | R3501 | |
6-bromo-1H-indazol-3-amine | Alfa Aesar | H34095 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
magnesium sulfate, heptahydrate | Sigma | M1880 | |
ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
zinc sulfate, heptahydrate | Sigma | Z0251 | |
ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
butyric acid, liquid | Sigma | B103500 | |
resazurin powder | Sigma | R7017 | |
sodium chloride | J.T. Baker | 4058-01 | |
prepared resazurin solution | Invitrogen | DAL1100 | |
PCR stickers | Denville | B1212-5 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | M5 | |
96-well, tissue culture treated microplates | Corning | 3595 | |
reagent reservoirs | VWR | 89094-678 | |
resealable plastic bags | VWR | 395-94602 | |
14 mL Polypropylene round-bottom tubes | Corning | 352059 | |
50 mL conical centrifuge tube | Corning | 352070 | |
75 cm2 Cell culture flask | Corning | 431464U | |
clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate | Costar | 3595 | |
Prism 6 for OS X | GraphPad | http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
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