अर्द्ध मात्रात्मक, मध्यम throughput माइक्रोबैक्टीरिया की गणना के लिए लकड़ी का कोयला अग्रवाल Resazurin परख के दृश्य

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

खोज और प्रगति विरोधी infectives कि क्षय रोग (टीबी) उपचार की अवधि को छोटा करने के लिए एक तत्काल आवश्यकता है। माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग, टीबी के etiological एजेंट, प्रदर्शन प्ररूपी दवा प्रतिरोध बेसिली की उपस्थिति के कारण तेजी से और स्थायी कीमोथेरेपी के लिए आग रोक है। ग harcoal एक gar एक ssay (कारा) esazurin r नकल और गैर नकल एम तपेदिक के खिलाफ उच्च throughput स्क्रीनिंग अभियानों द्वारा की खोज की सक्रिय अणुओं को चिह्नित करने के लिए एक उपकरण के रूप में विकसित किया गया था। जीवाणु वैज्ञानिक अगर मध्यम में सक्रिय लकड़ी का कोयला का समावेश यौगिक कैरी ओवर के प्रभाव को कम करने में मदद करता है, और आवश्यकता के कारा microplates पर खोलना करने से पहले कोशिकाओं पूर्व पतला समाप्त। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 7-10 दिन ऊष्मायन अवधि के बाद, माइक्रोबैक्टीरियल कारा microplate कुओं की सतह पर बढ़ रही microcolonies द्वारा resazurin की कमी अर्द्ध मात्रात्मक asse परमिटfluorometry के माध्यम से जीवाणु की संख्या के ssment। कारा लगभग जीवाणु की संख्या में 2-3 लॉग ₁₀ अंतर का पता लगाता है और एक न्यूनतम जीवाणुनाशक एकाग्रता ≥99% जीवाणु को मार डालो (अति पिछड़े वर्गों _≥99) के लिए अग्रणी भविष्यवाणी की है। कारा तय है कि एक अणु बेसिली कि दोहरा रहे हैं, गैर नकल, या दोनों पर सक्रिय है में मदद करता है। कारा का उपयोग कर पायलट प्रयोगों पहचान जिनमें से परीक्षण एजेंट और यौगिक जोखिम के समय की एकाग्रता कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) assays के द्वारा आगे के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है की सुविधा। इसके अलावा, कारा यदि नकल actives जीवाणुनाशक या बैक्टीरियोस्टेटिक हैं भविष्यवाणी कर सकते हैं।

माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग, तपेदिक की etiological एजेंट, एक अव्यक्त राज्य में एक मेजबान है कि एंटीबायोटिक उन्मूलन के लिए आग रोक है में जीवित रह सकते हैं। प्ररूपी (गैर आनुवांशिक) संक्रमण के दौरान एम तपेदिक के प्रतिरोध, कारण होने की गैर नकल बेसिली ^1,2 की आबादी के हिस्से में माना जाता है। कक्षा मैं प्ररूपी दवा प्रतिरोध प्रदर्शित persisters दवा संवेदनशील कोशिकाओं ^3,4 की बड़ी आबादी के बीच में दुर्लभ स्टोकेस्टिक तंत्र के माध्यम से उत्पन्न होती हैं। द्वितीय श्रेणी persisters मेजबान प्रतिरक्षा के कारकों, संक्रमण के दौरान सामना करना पड़ा microenvironments में बाहरी तनावों सहित द्वारा गैर नकल गाया जाता है। हमने हाल ही में द्वितीय श्रेणी के इन विट्रो मॉडल विकसित गैर नकल हठ सक्रिय मैक्रोफेज और कणिकागुल्मों में एम तपेदिक द्वारा सामना की स्थिति नकल करने के लिए। द्वितीय श्रेणी के हठ की बहु तनाव मॉडल है कि शर्तों में शामिल है इस तरह के एक फैटी एसिड कार्बन स्रोत है, और पूरी तरह से एचएएल के रूप में धीमी गति से विकास,इस तरह के हल्के अम्लता (5.0 पीएच), हाइपोक्सिया (1% ओ _2), और नाइट्रिक ऑक्साइड और अन्य प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन मध्यवर्ती ^5-9 के रूप में टी विकास। बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग गैरप्रतिकृति के इस बहु तनाव मॉडल को रोजगार, और अन्य द्वितीय श्रेणी गैर नकल मॉडल, विविध अणुओं गतिविधि जिसका गैर नकल राज्य ^5-7,9-18 के खिलाफ निर्देशित है प्राप्त हुए है। एक ही गैर नकल स्क्रीन भी अणुओं है कि दोनों नकल और गैर नकल बेसिली के खिलाफ गतिविधि के अधिकारी के एक वर्ग का पता चला, कहा "दोहरी actives" ^{7,10,12,19,20।}

हिट-टू-लीड चरण में जीवाणुरोधी दवाओं की खोज के उम्मीदवार के अणुओं की व्यापक लक्षण वर्णन जरूरत पर जोर देता हिट विस्तार, प्रारंभिक लक्षण वर्णन pharmacologic, लक्ष्य की पहचान है, और प्रारंभिक इन विवो प्रभावकारिता के अध्ययन के लिए सुराग चुनने के लिए। एक प्रारंभिक कदम के रूप में, विरोधी infectives कार्रवाई के अपने बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक तंत्र द्वारा वर्गीकृत कर रहे हैं और, अगर जीवाणुनाशक, whether जीवाणु को मारने के समय और / या एकाग्रता पर निर्भर है। कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) परख इन सवालों को संबोधित करने के लिए शास्त्रीय, सोने के मानक तरीका है। CFU परख में, जीवाणु एक परीक्षण एजेंट, जिसके बाद aliquots, हटा रहे हैं क्रमानुसार पतला करने के लिए सामने आ रहे हैं, और dilutions की aliquots ठोस जीवाणु वैज्ञानिक माध्यम पर फैल गया है और जीवित कोशिकाओं के विकास की अनुमति के लिए incubated हैं। अंत में, बैक्टीरियल कालोनियों गिनाए जाते हैं। CFU परख जीवित कालोनियों गणना करने के लिए कोशिकाओं और आगर-युक्त पेट्री प्लेटों को कमजोर करने microtiter प्लेटों की बड़ी संख्या की आवश्यकता है। धीमी गति से बढ़ रही है माइक्रोबैक्टीरिया के लिए CFU परख अपनी धीमी पीढ़ी समय (18-24 घंटा) है, जो लगभग 3 सप्ताह की आवश्यकता कालोनियों प्लेटों पर प्रकट करने के लिए आड़े आती है। इसके अलावा, इनक्यूबेटर अंतरिक्ष अक्सर विशेष जैव सुरक्षा स्तर -3 सुविधाओं में सीमित है।

जबकि बोझिल, CFU assays mycobacter पर गैर नकल और दोहरे सक्रिय अणुओं के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए स्वर्ण मानक हैंमैं एक। गैर नकल assays उच्च झूठी सकारात्मक दरों के रूप में कई assays नकल सेलुलर व्यवहार्यता ^6-8 का आकलन करने के लिए मिलकर कर रहे हैं के अधीन हैं। उदाहरण के लिए, एक यौगिक एम तपेदिक नकल के खिलाफ शक्तिशाली गतिविधि है कि (एक "सक्रिय नकल") गैर नकल परख के दौरान मारने के लिए विफल हो सकता है, फिर भी अभी की गैर नकल चरण से कैरी ओवर की हैसियत से मार सकते हैं परख है, जो कि प्रतिकृति ( "की स्थिति नकल") का समर्थन शर्तों के तहत आयोजित किया जाता है की वसूली चरण के लिए परख। यौगिक आगे पर ले दोहरी सक्रिय अणुओं के विश्लेषण पेचीदा हो, यह मुश्किल है कि क्या गतिविधि नकल किया गया था, गैर नकल, या दोहरी भेद करने के लिए कर रही है।

मुद्दों के ऊपर वर्णित को संबोधित करने के लिए, हम इस तरह के एम tubercul के रूप में ग harcoal एक gar आर तेजी, माइक्रोबैक्टीरियल प्रजातियों में से अर्द्ध मात्रात्मक गणना के लिए एक ssay (कारा) esazurin विकसितOSIS, एम बोविस बीसीजी, और एम smegmatis ⁷ (आंकड़े 1 और 2)। इन विट्रो में बफर समाधान में, सक्रिय लकड़ी का कोयला तेजी से मानक तपेदिक ⁷ के इलाज के लिए इस्तेमाल दवाओं के सबसे sequesters। कारा में सक्रिय लकड़ी का कोयला microplates यौगिकों कि एक परख microplate से ले सकता है बांधता है, और कारा की इस सुविधा आवश्यकता क्रमानुसार ^7,21,22 गणन करने से पहले अच्छी तरह से परख सामग्री को कमजोर करने के लिए समाप्त। कारा microplates की अगर सतह पर माइक्रोबैक्टीरियल microcolonies की संख्या resazurin के अलावा द्वारा अनुमान लगाया गया है, एक नीले रंग की डाई, जिसका कम फार्म, resorufin, एक गुलाबी अणु प्रतिदीप्ति जिसका एक spectrophotometry ²³ से मापा जाता है। कारा microplates एम smegmatis के लिए 1-2 दिनों के लिए और इस तरह एम तपेदिक और एम बोविस बीसीजी के रूप में धीमी गति से बढ़ रही है माइक्रोबैक्टीरिया के लिए 7-10 दिनों के लिए incubated हैं। कारा के ~ 2-3 लॉग ₁₀ diffe एक संकीर्ण गतिशील रेंज हैCFU में Rence। जब एक CFU परख के बजाय प्रयोग किया, एक एकल कारा microplate लगभग पाँच 96 अच्छी तरह से धारावाहिक dilutions और 120 त्रिकोणीय शैली अगर प्लेट चढ़ाना के लिए इस्तेमाल के लिए इस्तेमाल किया प्लेटों की जगह। कारा डेटा की व्याख्या जो ऊष्मायन बार और यौगिक सांद्रता का निर्धारण अधिक श्रमसाध्य CFU आधारित assays में परीक्षण करने के लिए बाद में पढ़ाई द्वारा मार्गदर्शन में मदद करता है।

1. कारा microplates की तैयारी

1. एक 2 एल Erlenmeyer फ्लास्क में 0.2% और 0.4% ग्लिसरॉल सक्रिय लकड़ी का कोयला युक्त Middlebrook 7H11 अगर की आटोक्लेव 900 मिलीलीटर, या वैकल्पिक रूप से, एक 1 एल कांच बीकर में 450 मिलीलीटर। कुप्पी या बीकर में एक बड़ी autoclavable हलचल बार शामिल हैं। कुप्पी या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर के उद्घाटन के कवर और आटोक्लेव टेप के साथ कांच के लिए देते हैं।
2. एक चुंबकीय हलचल प्लेट एक कम गति पर सेट निलंबन में लकड़ी का कोयला बनाए रखने के लिए पर (लगभग 55-65 डिग्री सेल्सियस) छूने के लिए अच्छा।
3. एक जैव सुरक्षा हुड एक चुंबकीय हलचल की थाली है कि में aseptically बाद के सभी चरणों का प्रदर्शन।
4. पन्नी निकालें। 100 मिलीलीटर OADC पूरक जोड़ें (OADC पूरक, जब 10% से कम इस्तेमाल किया, 0.2% डेक्सट्रोज, 0.5% एल्बुमिन, 0.085% सोडियम क्लोराइड, 0.0005% ओलिक एसिड, और 0.4 मिलीग्राम / एमएल catalase की पैदावार अंतिम मीडिया सांद्रता) 2 एल Erlenmeyer फ्लास्क , या 1 एल बीकर को 50 मिलीलीटर OADC, और मिश्रण जारी है।
5. एक Erlenmeyer फ्लास्क का उपयोग करते हैं, लगभग 25-4 डालनाएक बाँझ अभिकर्मक जलाशय में 7H11-OADC-लकड़ी का कोयला के 0 मिलीलीटर। बीकर का उपयोग करते हैं, यह एक अभिकर्मक जलाशय का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है।
6. 200 μl / अच्छी तरह से अभिकर्मक जलाशय या बीकर से 7H11-OADC-लकड़ी का कोयला के साथ एक 96 अच्छी तरह से microplate भरें। जल्दी से काम अगर solidification और बुलबुले की शुरूआत से बचने के लिए। कुओं की ठोस मध्यम बाहर splashing, के रूप में है कि कवक संक्रमण के एक स्रोत हो सकता से बचें। एक multichannel विंदुक का प्रयोग, 96 अच्छी तरह से थाली के 8 पंक्तियों (एएच) को 7H11-OADC-लकड़ी का कोयला के हस्तांतरण के लिए 12 फिल्टर सुझावों में से एक सेट का उपयोग करें।
   ध्यान दें: मध्यम जल्दी से solidifies। पिपेट सुझावों के clogging से बचने के लिए उन्हें बार-बार बदल जाते हैं।
7. वैकल्पिक रूप से, फिल्टर सुझावों के साथ एक P1000 इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कई प्लेटें तैयार करने में सहायता करने के लिए microplates कारा डालना।
   नोट: microplate कुओं की कम मात्रा के कारण, कारा microplates में अगर डालने का कार्य के मिनट के भीतर solidifies।
8. resealable प्लास्टिक बीए में कारा microplates के प्लेस ढेरजीएस बाहर सुखाने से बचने के लिए।
9. स्टोर कारा microplates 4 डिग्री सेल्सियस पर।

2. ₉₀ Assays नकल की स्थापना और गैर नकल एमआईसी

1. एम तपेदिक, एम बोविस बीसीजी टीका लगाना या एम एक आयुध डिपो 0.01-0.1 के ₅₈₀ में smegmatis और Middlebrook 7H9-डी एन में मध्य लॉग चरण (आयुध डिपो ₅₈₀ ~ 0.5) का विस्तार (Middlebrook 7H9 0.2% ग्लिसरॉल युक्त, 0.2% डेक्सट्रोज 0.5% एल्बुमिन, और 0.085% NaCl) या 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 0.2% ग्लिसरॉल और 10% OADC पूरक युक्त)।
2. एम तपेदिक और एम बोविस बीसीजी ~ के रूप में सेल संस्कृति बोतल में संस्कृतियों खड़े 20 मिलीलीटर बढ़ो और एम polypropylene दौर नीचे (4 मिलीलीटर संस्कृति) या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब (10-20 मिलीलीटर संस्कृति) में झटकों के साथ smegmatis। 20% ₂ हे और 5% सीओ _{2 के} साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रोगजनक माइक्रोबैक्टीरिया सेते हैं, और एम 20% ओ _{2 के} साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर smegmatis।
3. एक न्यूनतम-निरोधात्मक सेट अपएकाग्रता (एमआईसी ₉₀₎ नकल और गैर नकल की स्थिति (चित्रा 2) के तहत शैली प्रयोग।
   नोट: टेस्ट एजेंट आमतौर पर डुप्लिकेट या quadruplicates में यत्न कर रहे हैं परीक्षण 4, या 2 यौगिकों, क्रमश: प्रति 96 अच्छी तरह से microplate की अनुमति के लिए। उदाहरण के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली में, एक परीक्षण एजेंट पंक्तियों ई और एक अन्य पंक्तियों एह में यत्न किया जा सकता है। DMSO (वाहन) कॉलम 1, 2 में है, और 12, और परीक्षण एजेंट कमजोर पड़ने श्रृंखला स्तंभ 11 (सर्वोच्च एकाग्रता) के कॉलम 3 (सबसे कम एकाग्रता) से चलाता है। एमआईसी ₉₀ शैली assays आम तौर पर 2 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला को रोजगार। वहाँ कई गैर नकल मॉडल माइक्रोबैक्टीरिया ^{14-16,18,24,25} के लिए उपलब्ध हैं और निदर्शी प्रयोजनों के लिए, हम गैर प्रतिकृति ^6,8,9 की एक बहु तनाव मॉडल का उपयोग कर रहे हैं।
   1. नकल परख के लिए, एक स्पष्ट तली, टिशू कल्चर इलाज 96 अच्छी तरह से थाली के सभी कुओं में एक आयुध डिपो 0.01 से ₅₈₀ पर 7H9-डी एन में 200 μl कोशिकाओं वितरित।
   <li> गैर नकल परख के लिए, कोशिकाओं को दो बार फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 0.02% tyloxapol युक्त धोने, और गैर नकल मध्यम (0.05% के.एच. _{2 4} पीओ, 0.05% MgSO _4, 0.005% फेरिक अमोनियम साइट्रेट में resuspend कोशिकाओं , 0.0001% ZnCl _2, 0.1% एनएच ₄ सीएल, 0.5% बीएसए, 0.085% सोडियम क्लोराइड, 0.02% tyloxapol, 0.05% butyrate, पीएच 2 एन NaOH के साथ 5.0 करने के लिए समायोजित)।
   1. गैर नकल माध्यम में एक आयुध डिपो 0.1 के ₅₈₀ करने के लिए कोशिकाओं पतला और 0.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक नया तैयार 1 एम स्टॉक से नैनो ₂ जोड़ें।
   2. एक स्पष्ट तली, टिशू कल्चर इलाज 96 अच्छी तरह से थाली के सभी कुओं में एक आयुध डिपो 0.1 के ₅₈₀ में 200 μl कोशिकाओं बांटो।
      नोट: DMSO में 100 गुना शेयर समाधान के रूप में यौगिक dilutions तैयार करें। इस प्रकार, एक ठेठ एमआईसी प्लेट अंतिम एकाग्रता 0.4-100 माइक्रोग्राम पर एक अणु के प्रभाव का परीक्षण / एमएल DMSO में 0.04-10 मिलीग्राम / एमएल के शेयर समाधान की आवश्यकता होगी।
4. di के 2 μl जोड़ेमें पंक्तियों एई परीक्षण एजेंट 1 के lutions और पंक्तियों एह में परीक्षण एजेंट 2 के dilutions के 2 μl। अच्छी तरह से मिश्रण।
5. 2 μl वाहन नियंत्रण (आमतौर पर DMSO) नियंत्रण कुओं में जोड़ने, कॉलम 1, 2, 12 (पंक्तियों एएच)। अच्छी तरह से मिश्रण।
6. एक प्रयोग के लिए, ऐसे 0.004 करने के लिए 1 माइक्रोग्राम / एमएल (नकल परख) और / या 0.08 से 20 माइक्रोग्राम / एमएल (गैर नकल परख) से रिफैम्पिसिन के रूप में कम से कम एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं।
   नोट: 0.1 से 25 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में 6-ब्रोमो-1H-indazol-3-एमाइन ⁹ के उपयोग के लिए एक नियंत्रण यौगिक चयनात्मक है कि, गैर प्रतिकृति की बहु तनाव मॉडल में नैनो ₂ निर्भर गतिविधि के रूप में सिफारिश की है।
7. Assays नकल के लिए, 7 दिन (एम तपेदिक और एम बोविस बीसीजी) या 1-48 घंटा (एम smegmatis) के लिए 20% ₂ हे और 5% सीओ ₂ में 37 डिग्री सेल्सियस पर microplates सेते हैं। गैरप्रतिकृति की बहु तनाव मॉडल के लिए, 1% ₂ हे और 5% सीओ ₂ में 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए microplates सेते (<उन्हें> एम। तपेदिक और एम बोविस बीसीजी)।

3. कारा microplates का टीका

1. समय अंक जिसमें कारा एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, ध्यान से अच्छी तरह से एमआईसी ₉₀ शैली परख एक P200 मल्टीचैनल पिपेट 50-75 μl पर सेट का उपयोग कर प्लेट की सामग्री को resuspend। पिपेट ऊपर और नीचे कम से कम 5-10 बार और धीरे पिपेट सुझावों का उपयोग कर एक परिपत्र गति में अच्छी तरह से सामग्री ज़ुल्फ़।
2. स्थानांतरण कारा microplate को परख अच्छी तरह से सामग्री के 10 μl। सुनिश्चित करें कि परख थाली पर अच्छी तरह से सामग्री के आदेश कारा microplate की अच्छी तरह से सामग्री के आदेश मेल खाता है। स्थानान्तरण के दौरान splashing से बचें और सुनिश्चित करें कि 10 μl कारा microplate कुओं के बीच में देखा जाता है बनाते हैं। 10 μl पुष्टि कारा microplate में अवशोषित कर लेता है।
   नोट: कोई कारा microplates पर कोशिकाओं खोलना करने से पहले आवश्यक dilutions रहे हैं।
3. प्लेट टेप के साथ microplates कारा का बाँध के ढेर औरफिर एक resealable प्लास्टिक की थैली में रख दें। Microplates कारा सेते 20% ओ _{2 के} साथ 37 डिग्री सेल्सियस (एम smegmatis) या 1% ₂ हे और 5% सीओ ₂ (एम तपेदिक और एम बोविस बीसीजी) पर।
4. एम तपेदिक और एम बोविस बीसीजी के लिए, assays नकल: 7 दिनों के लिए सेते हैं; एम तपेदिक और एम बोविस के लिए बीसीजी गैर नकल assays, 10 दिनों के लिए सेते हैं; एम smegmatis के लिए, assays नकल, 1-2 दिनों के लिए सेते हैं; एम smegmatis के लिए, गैर नकल assays, 2-3 दिनों सेते हैं।
   नोट: समय अनुमान कर रहे हैं और विभिन्न नकल, गैर नकल, और तनाव की स्थिति के लिए तदनुसार संशोधित किया जा सकता है।

4. कारा microplates का विकास

1. microplates जब बैक्टीरिया विकास, या बड़ा, स्थूल कालोनियों की एक फिल्म, नकारात्मक (वाहन) नियंत्रण कुओं पर दिखाई दे रहे हैं कारा का विकास करना।
   नोट: लंबे समय तक ऊष्मायन के बाद, कारा microplate कुओं अक्सरसूखी दिखाई देते हैं और हम बाँझ पीबीएस के साथ पूर्व गीला अच्छी तरह से सामग्री सलाह देते हैं। इस resazurin है, जो कम रोशनी या अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से बदलाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं अवशोषित से लकड़ी का कोयला को रोकने के लिए कार्य करता है।
2. एक multichannel विंदुक के साथ 12 P200 सुझावों में से एक सेट का उपयोग करना, कुओं के पक्ष के साथ बाँझ पीबीएस के 40 μl बांटना और पीबीएस अगर / बैक्टीरियल microcolonies के शीर्ष भर में वितरित करने के लिए अनुमति देते हैं।
3. कारा 5 मिलीग्राम resazurin (0.01% अंतिम) और पीबीएस में 5% Tween80 की 50 मिलीलीटर मिश्रण से अभिकर्मक के विकास के लिए तैयार करें। भंवर और बाँझ फिल्टर।
   नोट: पीबीएस में 10% Tween80 के साथ 1 (/ खंड खंड): एक वैकल्पिक कारा विकासशील अभिकर्मक व्यावसायिक तौर पर 1 पर तरल समाधान resazurin तैयार मिश्रण से तैयार किया जा सकता है।
4. एक 12-चैनल पिपेट का उपयोग कारा microplate के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए हौसले से तैयार कारा विकासशील अभिकर्मक के 50 μl जोड़ें। रॉक प्लेटों के आगे और पीछे एक बार कुछ अच्छी तरह से प्रत्येक में अगर और बैक्टीरियल चटाई भर अभिकर्मक वितरित मदद करने के लिए।
5. प्लेटों जगह मैंna resealable प्लास्टिक की थैली और एम के लिए कम से कम 30 मिनट के smegmatis और एम तपेदिक या एम बोविस बीसीजी के लिए 45-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
   नोट: वाहन पर नियंत्रण कुओं पहले घंटे के भीतर गुलाबी बारी करने में विफल रहते हैं, प्लेटों को फिर से हासिल किया जा सकता है और समय की लंबी अवधि के लिए incubated।
6. प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए पहले, हटा उनकी पलकों के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एक जैव सुरक्षा हुड में microplates कारा जगह है। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के बाहर BSL3 स्पेक्ट्रो का उपयोग कर, प्लेट के ऊपर एक ऑप्टिकल गुणवत्ता पीसीआर स्टीकर पालन करना और एक नरम कागज तौलिया के साथ स्टीकर सतह पर धीरे दबाने से कसकर सील।
7. 590 एनएम पर 530 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ पढ़ने के शीर्ष के माध्यम से प्रतिदीप्ति निर्धारित करते हैं। यह खाली थाली करने के लिए आवश्यक नहीं है।

5. डेटा विश्लेषण

1. एक रेखीय पैमाने पर एक लॉग ₁₀ के पैमाने पर और वाई अक्ष पर प्रतिदीप्ति पर एक्स अक्ष पर प्लॉट अवरोध एकाग्रता। एक तितर बितर का प्रयोग करेंसाजिश एक वक्र रोजगार जैसे कि "बनाम प्रतिक्रिया-चर ढलान (4 पैरामीटर) अवरोध लॉग ऑन" के रूप में फिट बैठते हैं। प्लॉट डेटा बिंदुओं ± मानक त्रुटि का अर्थ है के रूप में।

प्रत्याशित कारा परिणाम चित्रा 2 में वर्णित है और तालिका 1 में संक्षेप हैं। कोशिकाओं को नकल करने के लिए, कारा एक मानक एमआईसी ₉₀ assays के साथ समानांतर में चला जाता है, और गैर नकल assays के लिए, कारा एक अनुकूलित एमआईसी ₉₀ परख है कि एक परिणाम चरण के लिए युग्मित है के साथ समानांतर में चलाया जाता है। परीक्षण एजेंट की एकाग्रता है कि कारा-प्रतिदीप्ति की विफलता पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर उठकर में यह परिणाम कारा-अति पिछड़े वर्गों _≥99 (चित्रा 3 ए) है। "≥99" सबस्क्रिप्ट इंगित करता है कि कारा-अति पिछड़े वर्गों के परीक्षण एजेंट की अनुमानित एकाग्रता है कि ≥2 लॉग ₁₀ जीवाणु को मार डालो (≥99% मार) को जन्म देता है।

तरल शोरबा एमआईसी ₉₀ परख जीवाणुनाशक और बैक्टीरियोस्टेटिक गतिविधि के बीच भेदभाव करने में असमर्थ है और इस तरह के अंतर एक CFU परख करके हल किया जाना है। द्वारासम्मेलन, सीमा है कि धीमी गति से बढ़ रही है माइक्रोबैक्टीरिया के लिए बैक्टीरियोस्टेटिक गतिविधि से जीवाणुनाशक अलग लगभग 2-3 लॉग ₁₀ 7 दिन ^7,26 से अधिक मार रहा है। चूंकि कारा के गतिशील रेंज भी 2-3 लॉग ₁₀ को मार रहा है, कारा जीवाणुनाशक या बैक्टीरियोस्टेटिक गतिविधि के एक अनुमान प्रदान कर सकते हैं। कारा आसानी से (चित्रा 2) इन यौगिकों की विफलता पृष्ठभूमि के स्तर को कम करने के लिए कारा प्रतिदीप्ति के कारण बैक्टीरियोस्टेटिक के रूप में कुछ नकल actives को पहचानती है। हालांकि, एम तपेदिक नकल के खिलाफ बैक्टीरियोस्टेटिक गतिविधि के साथ कुछ यौगिकों एक शक्तिशाली पद-एंटीबायोटिक प्रभाव है, जिसका अर्थ है कि वे भी यौगिक कैरी ओवर के अभाव में वसूली चरण के दौरान बैक्टीरिया के regrowth को बाधित करने के लिए जारी है। इस आशय की कारा परख में पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है। यौगिकों एक के बाद एंटीबायोटिक प्रभाव exerting के संदेह कर रहे हैं अगर वे एक "स्थिर खिड़की" प्रदर्शन, सही betwee करने के लिए एक> 4 गुना बदलाव के रूप में परिभाषित किया गयाn एमआईसी और कारा घटता (चित्रा 3 बी)। स्थिर खिड़की इंगित करता है कि एक अणु एम तपेदिक नकल के खिलाफ सक्रिय जीवाणुनाशक के बजाय बैक्टीरियोस्टेटिक हो सकता है। कुछ मामलों में, स्थिर Windows केवल कारा प्रतिदीप्ति (चित्रा -3 सी और 3 डी) के लिए एक विस्तारित वाई अक्ष के निरीक्षण के बाद स्पष्ट कर रहे हैं।

कारा और एमआईसी ₉₀ डेटा आमतौर पर एक साथ प्लॉट किए जाते हैं (चित्रा 4)। एमआईसी ₉₀ और कारा द्वारा परीक्षण replicating- और गैर नकल सक्रिय अणुओं के लिए प्रतिनिधि डेटा 4 चित्र में दिखाए जाते हैं। वहाँ अणुओं के लिए 4 प्रमुख गतिविधि वर्गों रहे हैं: 1) जीवाणुनाशक नकल (आइसोनियाजिड के साथ प्रदर्शन, चित्रा 4 ए); 2) नकल बैक्टीरियोस्टेटिक (linezolid, चित्रा 4 बी) के साथ प्रदर्शन किया; 3) गैर नकल जीवाणुनाशक (oxyphenbutazone, चित्रा 4C) के साथ प्रदर्शन किया; और, 4) प्रतिनिधिlicating-सक्रिय (बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक) और गैर नकल जीवाणुनाशक (PA-824, चित्रा 4D के साथ प्रदर्शन)। महत्वपूर्ण बात है, 4 ए के आंकड़े और प्रदर्शित 4 बी, जबकि आइसोनियाजिड और linezolid एमआईसी ₉₀ परख द्वारा गैर नकल बैक्टीरिया के खिलाफ गतिविधि दिखाई देते हैं, कारा पता चलता है कि वे परीक्षण गैर नकल की शर्तों के तहत निष्क्रिय हैं। एक अणु के समय और एकाग्रता पर निर्भर प्रभाव की भविष्यवाणी करने में कारा की उपयोगिता का परीक्षण करने के लिए, एम smegmatis नकल बढ़ती रिफैम्पिसिन की सांद्रता (आंकड़े 5 ए - घ) के संपर्क में था, और 1-24 मानव संसाधन के बीच विभिन्न समय पर, aliquots देखा गया कारा प्लेटों पर। इन आंकड़ों से संकेत दिया है कि रिफैम्पिसिन के रूप में जल्दी 1 घंटा (चित्रा 5 ए) के रूप में एक प्रभाव exerted, 3 और 24 घंटा (आंकड़े 5 ब-डी) के बीच बढ़ती जीवाणुनाशक गतिविधि दिखाया गया है, और 2 से ~ 10 माइक्रोग्राम / एमएल पर ≥2-3 लॉग ₁₀ मारे गए4 घंटा (चित्रा 5 डी)। इसी तरह का एक प्रयोग के एक वाहन पर नियंत्रण और 9 दवा सांद्रता के quadruplicates का परीक्षण, और 4 समय बिंदुओं पर, एक मानक CFU आधारित परख द्वारा निषेधात्मक होगा।

इस प्रकार, कारा एक अणु की गतिविधि प्रोफ़ाइल की पहचान करने के लिए एक माध्यम throughput, तीव्र तंत्र के रूप में दवाओं की खोज में एक भूमिका है। कारा भविष्यवाणियों कड़ाई से एक मानक CFU परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना चाहिए। CFU विश्लेषण के लिए पेट्री प्लेटों के लिए 0.4% सक्रिय लकड़ी का कोयला के अलावा कारा आंकड़ों के सह-संबंध को बेहतर बनाने में मदद कर सकता है, और अधिक सटीक CFU मायने में परिणाम हो सकता है, सुधार की भयावहता को आम तौर पर परिसर के शक्ति ^21,22 के लिए आनुपातिक जा रहा है।

चित्रा 1: कारा दवाओं की खोज में एक भविष्य कहनेवाला उपकरण है। यह चित्र एक के रूप में कारा की उपयोगिता का सारदवा स्क्रीनिंग (एकल बिंदु स्क्रीनिंग, चेरी उठा, और खुराक प्रतिक्रिया assays) और समय लेने वाली हिट-टू-लीड assays (CFU assays और लक्ष्य की पहचान) के बीच मध्यवर्ती चरण। [गोल्ड एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित।, रोगाणुरोधी एजेंटों और रसायन चिकित्सा, 2015 ^7] यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 2: शोरबा एमआईसी ₉₀ परख और कारा प्रत्याशित परिणामों के साथ के योजनाबद्ध। दोनों एमआईसी ₉₀ और कारा परिणाम 8 संभव गतिविधियों के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। रंग-कोडिंग एमआईसी ₉₀ microplate कुओं के लिए सफेद (कोई विकास) और भूरे रंग (विकास) है, और कारा के लिए microplates (कोई प्रतिदीप्ति) और गुलाबी (resorufin प्रतिदीप्ति) काला है। डेटा काल्पनिक हैं। [गोल्ड एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित।, रोगाणुरोधी एजेंटों और रसायन चिकित्सा, 2015 ^7] यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: विशेष कारा नियम और परिभाषाएँ। एक अणु प्रतिदीप्ति कारा की पृष्ठभूमि के स्तर में जिसके परिणामस्वरूप के न्यूनतम जीवाणुनाशक एकाग्रता कारा-अति पिछड़े वर्गों _≥99 है (क)। नकल शर्तों के तहत, एमआईसी ₉₀ के अधिकार के लिए कारा-अति पिछड़े वर्गों _≥99 की एक ≥4 गुना पारी अक्सर बैक्टीरियोस्टेटिक गतिविधि को इंगित करता है और एक "स्थिर खिड़की" (ख) कहा जाता है। एक शक्तिशाली पद-एंटीबायोटिक प्रभाव से अणुओं के लिए, स्थिर खिड़कियों का निरीक्षण करने के लिए (सी) और आवश्यकता मुश्किल हो सकता हैशाफ़्ट (कारा प्रतिदीप्ति) के विस्तार कल्पना करने के लिए (घ)। डेटा काल्पनिक हैं। [गोल्ड एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित।, रोगाणुरोधी एजेंटों और रसायन चिकित्सा, 2015 ^7] यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4: निदर्शी एमआईसी ₉₀ और कारा का चयन यौगिकों के लिए यह परिणाम है। एमआईसी ₉₀ (लाल) और कारा (नीला) के लिए डेटा के लिए (क) आइसोनियाजिड (INH), (ख) linezolid, (ग) oxyphenbutazone, और (घ) पीए 824 प्रदर्शन कर रहे हैं। जंगली प्रकार एम तपेदिक H37Rv मानक नकल की स्थिति या गैर प्रतिकृति ^7-9 की बहु तनाव मॉडल के तहत 7 दिनों के लिए यौगिकों के संपर्क में था। एमआईसी ₉₀ assays और कारा के रूप में चित्रा 2 में दिखाया प्रदर्शन किया गया। [गोल्ड एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित।, रोगाणुरोधी एजेंटों और रसायन चिकित्सा, 2015^7]यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 5: खुराक और रिफैम्पिसिन के समय पर निर्भर गतिविधि। गैर रोगजनक, तेजी से बढ़ती एम smegmatis नकल की स्थिति और aliquots के तहत रिफैम्पिसिन की बढ़ती सांद्रता के संपर्क में था पर कारा के लिए नमूना थे 1 (क), 3 (ख), 6 (ग) और 24 (घ) घंटा। [गोल्ड एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित।, रोगाणुरोधी एजेंटों और रसायन चिकित्सा, 2015 ^7].com / फ़ाइलें / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: चित्रा 2 में प्रत्याशित परिणामों का सारांश। [गोल्ड एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित।, रोगाणुरोधी एजेंटों और रसायन चिकित्सा, 2015 ^7] यहाँ इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

कारा मूल रूप से गैर नकल या दोहरे सक्रिय अणुओं ⁷ प्रगति में एक अड़चन को दूर करने के लिए विकसित किया गया था। कारा प्राथमिक स्क्रीनिंग हिट और CFU assays (चित्रा 1) की एकाग्रता-प्रतिक्रिया पुष्टि के बीच एक मध्यवर्ती कदम के रूप में कार्य करता है। चूंकि एक भी कारा प्लेट कई microtiter धारावाहिक dilutions तैयार करने की आवश्यकता प्लेटें, और अगर युक्त पेट्री प्लेटों जीवित बैक्टीरिया गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है जगह ले सकता है, कारा तेजी से एक अणु की गतिविधि का आकलन और यौगिक एकाग्रता सहित बार में कई चर, परीक्षण करने के लिए एक सरल साधन प्रदान करता है और मिश्रित करने के लिए जोखिम के समय।

एक CFU परख में, धारावाहिक dilutions है कि अक्सर 10 ⁶ गुना तक सीमा के अलावा, अगर प्लेट आम तौर पर एक अतिरिक्त ~ 800 गुना (एक त्रि-शैली पेट्री थाली में 8 मिलीलीटर पर 10 μl) द्वारा अणुओं dilutes। हमारे दो चरण, बहु तनाव पर सक्रिय यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग परख गैर नकल एम Tuberculosis परख की गैर नकल चरण में एक परिसर में मौजूद एक पांचवें परिणाम (नकल) परख ^6-9 के चरण में मूल एकाग्रता में मौजूद है, वह यह है कि 5 गुना की एक कैरी ओवर कारक है। कारा mitigates ले ओवर प्रभाव सक्रिय लकड़ी का कोयला के साथ छोटे अणुओं sequestering द्वारा। तपेदिक दवाओं और नैदानिक उम्मीदवारों के बहुमत सक्रिय लकड़ी का कोयला बाँध तेजी से और पूरी तरह से, अमिनोग्लाईकोसाइड स्ट्रेप्टोमाइसिन ⁷ के अपवाद के साथ। CFU assays के लिए अगर प्लेट में सक्रिय लकड़ी का कोयला के शामिल किए जाने से बैक्टीरिया विकास निषेध, या जीवाणु को मार डालो, रोका जाता ओवर TMC207 और पीए 824 ^7,21,22। इस प्रकार, जीवाणु वैज्ञानिक अगर में सक्रिय लकड़ी का कोयला शामिल करने के आधार पर, कारा नहीं कोशिकाओं और परीक्षण एजेंट के धारावाहिक dilutions पर निर्भर है।

कारा नकल Actives और गैर नकल actives का जीवाणुनाशक प्रभाव की बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक प्रभाव की भविष्यवाणी कर सकते हैं। जी मेंeneral, कारा मानक एमआईसी ₉₀ assays के साथ समानांतर में प्रयोग किया जाता है। कारा की भविष्यवाणी करने की शक्ति एमआईसी ₉₀ और कारा परिणाम (चित्रा 2 और 1 टेबल) की तुलना से आता है। जब विरोधी माइक्रोबैक्टीरियल एजेंटों अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया, कारा सही, गतिविधि है कि जीवाणुनाशक (चित्रा 4 ए) नकल है भविष्यवाणी कर सकते हैं नकल बैक्टीरियोस्टेटिक (चित्रा 4 बी), गैर नकल जीवाणुनाशक (चित्रा 4C), या दोहरी सक्रिय (चित्रा 4D)। कारा भी दोनों खुराक और समय के पार एक यौगिक की गतिविधि के सरल मूल्यांकन परमिट। अकेले CFU assays के प्रयास और सामग्री खुराक और समय की एक विस्तृत श्रृंखला पर एक यौगिक की गतिविधि का आकलन करने का एक बहुत आवश्यकता होती है, लेकिन कार्य प्रबंधनीय चित्रा 5 हो जाता है जब कारा परिणाम उन लोगों के लिए शर्तों की सीमा संकीर्ण जिसमें यौगिक प्रदर्शन सक्रिय है ( )।

कारा एक की कार्रवाई के अध्ययन में उपयोगिता है जबकिमाइक्रोबैक्टीरिया पर एनटीआई infectives, परख सीमाएँ हैं। कारा एक संकीर्ण गतिशील रेंज (2-3 लॉग ₁₀₎ है और जिन परिस्थितियों में एक की आशंका है वहां अधिक से अधिक 2 3 लॉग करने के लिए ₁₀ जीवाणु को मारने नहीं हो सकता है के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता। कारा भविष्यवाणियों एक और अधिक कठोर और सटीक विधि का उपयोग इस तरह के एक CFU परख के रूप में बैक्टीरियल नंबर, गणना करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। इस तरह के पीए के रूप में कुछ विरोधी infectives, के बाद एंटीबायोटिक प्रभाव, एम तपेदिक ⁷ नकल के खिलाफ जीवाणुनाशक और बैक्टीरियोस्टेटिक गतिविधि के साथ यौगिकों के बीच भेद करने के लिए एक उपकरण के रूप में भविष्य कहनेवाला कारा उलझाना कर सकते हैं।

वहाँ कारा की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए दो सिफारिशें की हैं। सबसे पहले, एक, microplates तेजी से अगर solidifies से पहले कारा डालना है, जबकि बड़ा शुद्धता को बनाए रखने और microwells के बाहर splashing से परहेज करना चाहिए। आवश्यक प्लेटों की संख्या के बावजूद, हम मध्यम के 0.5 से 1 एल बैचों में मदद करने के लिए मीटर बनाए रखने के लिए बनाने की सिफारिशसमय प्लेटों डालना आवश्यक की अवधि के लिए तरल रूप में edium। सुझावों के बदलने अक्सर जबकि मध्यम साथ microplates भरने आंशिक रूप से भरा हुआ युक्तियों का उपयोग से बचा जाता है। दूसरा, एक प्रतिकृति के बीच प्रतिदीप्ति में artifactual परिवर्तनशीलता को कम करना चाहिए। माइक्रोबैक्टीरियल microcolonies, इस तरह के एम तपेदिक जैसे रोगजनक माइक्रोबैक्टीरिया के लिए विशेष रूप से, अक्सर अनिश्चित हो जाना। उदाहरण के लिए, अगर सतह पर बढ़ रही microcolonies आकार, आकृति, ऊंचाई में भिन्न हो सकते हैं, या microplate कुओं की भीतरी दीवारों तक विस्तार कर सकता है। एक चुनौती के विकास अभिकर्मक के साथ समान रूप से सभी बेसिली को कवर करने के लिए है। एक और बाधा है कि 37 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक ऊष्मायन के बाद, कारा microplates की ठोस जीवाणु वैज्ञानिक मध्यम सूखी और विकासशील अभिकर्मक अवशोषित होने का खतरा बन सकता है। चूंकि सक्रिय लकड़ी का कोयला resazurin बाँध और प्रतिदीप्ति ⁷ बुझाने कर सकते हैं, वहाँ resazurin अवशोषित समाधान विकसित सूखे कुओं और सक्रिय charcoa के कारण अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से बदलाव हो सकता हैएल शमन resazurin प्रतिदीप्ति। पूर्व गीला तुरंत विकासशील अभिकर्मक जोड़ने से पहले पीबीएस के साथ सभी कारा microplate कुओं की सतह इन दोनों समस्याओं का mitigates - विकासशील अभिकर्मक सभी माइक्रोबैक्टीरियल कालोनियों समान रूप से पहुंच जाएगा, और resazurin सक्रिय लकड़ी का कोयला ऊपर सुरक्षित रूप से बनी हुई है। कारा की पहचान करने और माइक्रोबैक्टीरियल म्यूटेंट के phenotypes निस्र्पक, या अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए मध्यम throughput दवाओं की खोज assays में में आवेदन कर सकते।

इसमें ब्याज की कोई संघर्ष का खुलासा करने के लिए कर रहे हैं।

हम पांडुलिपि और रसायन शास्त्र की सहायता के लिए जे डेविड वारेन (वेल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज), जबकि कारा के विकास की समीक्षा के लिए विशेषज्ञ क्रिस्टिन बर्न्स-हुआंग के आभारी हैं। इस काम के बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन, एबी और ट्रांसलेशनल मेडिसिन में हावर्ड पी Milstein कार्यक्रम के टीबी ड्रग त्वरक कार्यक्रम, और एक एनआईएच टीबी रिसर्च यूनिट (U19 AI111143) द्वारा समर्थित किया गया। सूक्ष्म जीव विज्ञान और इम्यूनोलॉजी विभाग विलियम Randolph Hearst फाउंडेशन द्वारा समर्थित है। एसएसके एनआईएच अनुदान K08AI108799 द्वारा समर्थित किया गया।