Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.
Det er et presserende behov for å oppdage og utvikle seg antiinfektiva som forkorter varigheten av tuberkulose (TB) behandling. Mycobacterium tuberculosis, det etiologiske middel av TB, er upåvirkelig for rask og vedvarende kjemoterapi på grunn av tilstedeværelsen av bacilli utviser fenotypiske medikamentresistens. Den c harcoal en gar r esazurin en ssay (CARA) ble utviklet som et verktøy for å karakterisere aktive molekyler oppdaget av high-throughput screening kampanjer mot replikere og ikke-reproduserende M. tuberculosis. Inkludering av aktivt kull i bakteriologiske agar medium bidrar til å redusere effekten av sammensatte carry-over, og eliminerer behovet for å pre-fortynne celler før spotting på CARA mikro. Etter en 7-10 dagers inkuberingsperiode ved 37 ° C, reduksjon av resazurin av mykobakterielle mikrokolonier som vokser på overflaten over Cara mikroplate brønnene tillater semikvantitativ assevurdering av bakterietall via fluorometri. Den CARA oppdager omtrent en 2-3 log 10 forskjell i bakterietall og spår en minimal bakteriedrepende konsentrasjon fører til ≥99% bakteriell drepe (MBC ≥99). Cara på å avgjøre hvorvidt et molekyl som er aktiv på basiller som er replikere, ikke-replikerende, eller begge deler. Pilot eksperimenter med Cara lette identifiseringen av hvilken konsentrasjon av testmiddel og tid av forbindelse eksponering kreve ytterligere evaluering av kolonidannende enhet (CFU) analyser. I tillegg kan CARA forutsi om replikere Actives er bakteriedrepende eller bakteriostatisk.
Mycobacterium tuberculosis, den agens av tuberkulose, kan overleve i en vert i en latent tilstand som ikke kan behandles med antibiotika utrydding. Fenotypiske (ikke-genetisk) motstand av M. tuberculosis under infeksjon antas å skyldes, delvis, til populasjoner av ikke-reproduserende basiller 1,2. Oppstå i klasse I persisters viser fenotypisk resistens via sjeldne stokastiske mekanismer blant store grupper av narkotika sensitive celler 3,4. Klasse II persisters gjengis ikke-reproduserende av faktorer av verten immunitet, inkludert ytre påkjenninger i microenvironments oppstått under infeksjon. Vi har nylig utviklet en in vitro modell av klasse II ikke-reproduserende utholdenhet for å etterligne forholdene konfrontert med M. tuberculosis i aktiverte makrofager og granulomer. Den multi-stress modell av klasse II persistens omfatter forutsetning av at langsom vekst, slik som en fettsyre karbonkilde, og helt halt vekst, såsom mild syre (pH 5,0), hypoksi (1% O 2), og nitrogenoksid og andre reaktive nitrogenmellomprodukter 5-9. Storskala screening ved anvendelse av denne multi-stress modell av ikke-replikasjon, og andre klasse II ikke-reproduserende modeller, har resultert i forskjellige molekyler hvis aktivitet er rettet mot den ikke-reproduserende tilstand 5-7,9-18. De samme ikke-reproduserende skjermer også avdekket en kategori av molekyler som innehar aktivitet mot både replikere og ikke-replikerende basiller, kalt "dual aktive" 7,10,12,19,20.
Antibakteriell stoffet funnet i hit-til-ledelsen fase innebærer omfattende karakterisering av kandidatmolekyler for å velge leder for hit ekspansjon, foreløpig farmakologisk karakterisering, mål identifikasjon, og foreløpige studier in vivo effekt. Som et tidlig trinn blir antiinfektiva klassifisert etter deres bakteriostatisk eller bakteriedrepende virkningsmekanisme, og hvis bakteriedrepende, whether bakteriell kill er tids- og / eller konsentrasjonsavhengig. Den kolonidannende enhet (CFU) analysen er den klassiske, gull standard metode for å håndtere disse spørsmålene. I CFU-analysen, blir bakterier utsettes for en testmiddel, hvoretter alikvoter fjernes, fortynnet i serie, og alikvoter av fortynninger er spredt på fast bakteriologiske medium og inkubert for å tillate vekst av overlevende celler. Endelig er bakteriekolonier nummerert. CFU-assay krever et stort antall mikrotiterplater for å fortynne cellene og agar inneholdende Petri-plater for å telle overlevende kolonier. CFU-analysen for langsomtvoksende mykobakterier er hemmet av sin langsomme generasjon tid (18-24 timer), noe som krever omtrent 3 uker for kolonier som skal vises på platene. Videre er inkubatorplass ofte begrenset i spesialiserte biosikkerhet-nivå-3 anlegg.
Mens tungvint, CFU analysene er gullstandarden for å karakterisere virkningen av ikke-reproduserende og dual-aktive molekyler på mycobacteria. Ikke-reproduserende analyser er underlagt høye falske positive priser som mange er koplet til replikere analyser for å vurdere cellulær levedyktighet 6-8. For eksempel kan en forbindelse som har sterk aktivitet mot replikere M. tuberculosis (en "replikerende aktiv") kan mislykkes i å drepe i løpet av den ikke-reproduserende assay, men kan likevel drepe i kraft av overheng fra den ikke-reproduserende fase av analyse for å restitusjonsfasen av forsøket, som er utført under betingelser som støtter replikasjon ( "replikerende forhold"). Forbindelse bære over ytterligere kompliserer analyse av to aktive molekyler, noe som gjør det vanskelig å skille hvorvidt aktiviteten ble replikerende, ikke-replikerende, eller dobbel.
For å løse problemene som er beskrevet ovenfor, har vi utviklet c harcoal en gar r esazurin en ssay (CARA) for rask, semi-kvantitativ telling av mykobakterielle arter som M. tuberculosis, M. bovis BCG og M. smegmatis 7 (figur 1 og 2). I bufferløsninger in vitro, aktivt kull sequesters raskt meste av standard legemidler som brukes til behandling av tuberkulose 7. Aktivt kull i CARA mikro binder forbindelser som kan bære over fra en analyse mikro, og denne funksjonen av CARA eliminerer kravet om å serielt fortynne analysen vel innholdet før telling 7,21,22. Antallet mykobakterielle mikrokoloniene på agaroverflaten av CARA mikroplater blir estimert ved tilsetning av resazurin, et blått fargestoff, som har redusert form, resorufin, er en rosa molekyl hvis fluorescens blir målt ved en spektrofotometri 23. CARA mikro inkuberes i 1-2 dager for M. smegmatis og 7-10 dager for langsomt voksende mykobakterier som M. tuberculosis og M. bovis BCG. Den CARA har et smalt dynamisk område på ~ 2-3 log 10 diffeRence i CFU. Når den brukes i stedet for en CFU assay, erstatter en enkelt CARA mikro omtrent fem 96-brønners plater som brukes til serie-fortynninger og 120 tri-stil agarplater som brukes for plettering. Tolkning av CARA data hjelper veilede senere studier ved å bestemme hvilke inkubasjon tider og sammensatte konsentrasjoner for å teste i mer arbeidskrevende CFU-baserte analyser.
1. Utarbeidelse av CARA Mikro
2. Sette opp Replikere og ikke-reproduserende MIC 90 Analyser
3. Inokulering av CARA Mikro
4. Utvikle CARA Mikro
5. Data Analysis
Forventede CARA Resultatene er beskrevet i figur 2 og oppsummert i tabell 1. For replikerende celler, blir Cara kjøres parallelt med en standard MIC 90 analyser, og for ikke-replikerende analyser, blir Cara drives i parallell med et tilpasset MIC 90 assay som er koplet til en utvekst fase. Den konsentrasjon av testmiddel som resulterer i svikt av CARA-fluorescens å stige over bakgrunnsnivået er Cara-MBC ≥99 (figur 3a). Den "≥99" senket indikerer at CARA-MBC gir en beregnet konsentrasjon av testmiddel som gir opphav til ≥2 log 10 bakteriell drepe (≥99% kill).
Den flytende buljong MIC 90-analysen er i stand til å skille mellom bakteriedrepende og bakteriostatisk aktivitet og dette skillet må løses ved en CFU analysen. Avkonvensjonen, terskelen som skiller bakteriedrepende fra bakteriostatisk aktivitet for saktevoksende mykobakterier er ca 2-3 log 10 drap i løpet av 7 dager 7,26. Siden det dynamiske område for Cara er også 2-3 log 10 drepe, kan Cara tilveiebringe et estimat av baktericid eller bakteriostatisk aktivitet. Den CARA lett identifiserer noen replikere aktive som bakteriostatisk til som følge av disse forbindelsene for å redusere CARA fluorescens bakgrunnsnivå (figur 2). Men noen forbindelser med bakteriostatisk aktivitet mot replikerende M. tuberculosis har en potent post-antibiotisk virkning, noe som betyr at de fortsetter å hemme gjenvekst av bakterier under gjenvinningsfasen, selv i fravær av forbindelse overheng. Denne effekten kan være vanskelig å gjenkjenne i Cara analysen. Forbindelser er mistenkt for å utøve en post-antibiotisk virkning hvis de viser en "statisk vindu", definert som en> 4-gangers forskyvning til høyre between MIC og CARA kurver (figur 3b). Den statiske vinduet indikerer at et molekyl aktive mot replikere M. tuberculosis kan være bakteriostatisk stedet for bakteriedrepende. I noen tilfeller, de statiske vinduene er synlig etter inspeksjon av et ekspandert Y-aksen for CARA fluorescens (figur 3c og 3d).
CARA og MIC 90 data er vanligvis plottet sammen (figur 4). Representative data for replicating- og ikke-replikerende-aktive molekyler som ble testet ved MIC 90 og CARA er vist i figur 4. Det er 4 store aktivitet klasser for molekyler: 1) replikere bakteriedrepende (demonstrert med isoniazid, figur 4a); 2) replikere bakteriostatisk (demonstrert med linezolid, figur 4b); 3) ikke-reproduserende bakteriedrepende (demonstrert med oksyfenbutason, figur 4c); og 4) replicating-aktiv (bakteriostatisk eller bakteriedrepende) og ikke-reproduserende bakteriedrepende (demonstrert med PA-824, figur 4d). Viktigere, Figurene 4a og 4b viser at mens isoniazid og linezolid synes å ha aktivitet mot ikke-replikerende bakterier av MIC-analysen 90, antyder Cara de er inaktive under de ikke-replikerende testede betingelser. For å teste anvendeligheten av Cara i å forutsi et molekyl som er tids- og konsentrasjonsavhengig effekt, replikerende M. smegmatis ble utsatt for økende konsentrasjoner av rifampicin (figurene 5a - d), og på forskjellige tidspunkter mellom 1-24 timer ble aliquoter flekket på CARA plater. Disse data indikerte at rifampicin utøves en påvirkning så tidlig som i 1 time (figur 5a), viste økt baktericid aktivitet mellom 3 og 24 timer (figurene 5b-d), og drepte ≥2-3 log 10 på ~ 10 pg / ml ved to4 timer (figur 5d). Et lignende eksperiment testing quadruplicates av en bærerkontroll og 9 medikamentkonsentrasjoner, og ved 4 tidspunkter, ville være prohibitive ved en standard CFU-baserte analysen.
Således har CARA en rolle i medisiner som et medium-throughput, hurtig mekanisme for å identifisere et molekyl aktivitetsprofil. CARA spådommer bør strengt evaluert ved hjelp av en standard CFU analysen. Tilsetningen av 0,4% aktivkull til Petri-plater for CFU-analysen kan bidra til å forbedre korrelasjon til CARA data, og kan gi en mer nøyaktig CFU tellinger, størrelsen av korreksjonen generelt å være proporsjonal med forbindelsens styrke 21,22.
Figur 1: CARA er en prediktiv verktøy i medisiner. Dette diagrammet oppsummerer nytten av CARA som enmellomstadium mellom narkotika screening (single point screening, cherry-picking, og dose-respons-analyser) og tidkrevende hit-til-bly-analyser (CFU-analyser og målet identifikasjon). [Hentet med tillatelse fra Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2015 7] Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjematisk av kjøttkraft MIC 90 analysen og CARA med forventede resultater. Begge MIC 90 og CARA resultatene blir presentert for 8 mulige aktiviteter. Den fargekoding for MIC 90 mikroplate brønnene er hvit (ingen vekst) og brun (vekst), og for CARA mikro er svart (ingen fluorescens) og rosa (resorufin fluorescens). Dataene er hypotetisk. [Tilpasset med tillatelse fra Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2015 7] Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Spesielle CARA begreper og definisjoner. Den minimale baktericide konsentrasjonen av et molekyl som fører til bakgrunnsnivåer av CARA fluorescens er Cara-MBC ≥99 (a). Under replikerende betingelser, en ≥4 gangers forskyvning av Cara-MBC ≥99 til høyre for MIC 90 indikerer ofte bakteriostatisk aktivitet, og som kalles en "statisk-vindu" (b). For molekyler med en potent post-antibiotiske virkning, kan statiske vinduer være vanskelig å observere (c) og kreverutvidelse av Y-aksen (CARA fluorescens) for å visualisere (d). Dataene er hypotetisk. [Hentet med tillatelse fra Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2015 7] Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Illustrasjons MIC 90 og CARA resultater for utvalgte forbindelser. Data for MIC 90 (rød) og CARA (blå) er vist for (a) isoniazid (INH), (b) linezolid, (c) oksyfenbutazon, og (d) PA-824. Villtype M. tuberculosis H37Rv ble eksponert for forbindelsene i 7 dager under standardbetingelser Replikere eller multi-stress modell av ikke-replikasjon 7-9. MIC 90-analyser og CARA ble utført som vist i figur 2. [Hentet med tillatelse fra Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 20157]Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: dose- og tidsavhengig aktivitet av rifampicin. Den ikke-patogene, hurtigvoksende M. smegmatis ble utsatt for økende konsentrasjoner av rifampicin i henhold replikerende betingelser og prøver ble samlet inn for CARA ved 1 (a), 3 (b), 6 (c) og 24 (d) hr. [Hentet med tillatelse fra Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2015 7].com / filer / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Oversikt over forventede resultater i figur 2. [Hentet med tillatelse fra Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2015 7] Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Den CARA ble opprinnelig utviklet for å lindre en flaskehals i framdrift ikke-reproduserende eller dual-aktive molekyler 7. Cara tjener som et mellomliggende trinn mellom konsentrasjon-respons bekreftelse av primære screening treff og CFU-analyser (figur 1). Siden en enkelt CARA plate kan erstatte mange mikrotiterplater forpliktet til å utarbeide serielle fortynninger, og agar-holdige Petri plater som brukes til å nummerere overlevende bakterier, gir en enkel måte å vurdere raskt et molekyl aktivitet og teste flere variabler samtidig, inkludert sammensatte konsentrasjon av CARA og eksponeringstiden til forbindelsen.
I en CFU-analyse, i tillegg til serielle fortynninger som ofte strekker seg opp til 10 6-doble, agarplaten fortynner typisk molekyler ved en ytterligere ~ 800-fold (10 ul ut mot 8 ml i en tri-stil Petri-plate). Våre to-trinns, multi-stress screening test for forbindelser aktive på ikke-reproduserende M. tuberculosis har et overheng faktor av 5-ganger, det vil si en forbindelse som er tilstede i den ikke-reproduserende trinn av analysen er til stede ved en femtedel den opprinnelige konsentrasjon i utveksten (replikerende) fase av analysen 6-9. Cara reduserer bære-over effekter av avsette små molekyler med aktivt kull. Flertallet av tuberkulose og kliniske kandidater binder aktivert trekull raskt og fullstendig, med unntak av streptomycin 7 aminoglykosider. Inkludering av aktivt kull i agarskåler for CFU analyser forhindret bakterieveksthemming, eller bakteriell drepe, etter gjennomført-over TMC207 og PA-824 7,21,22. Således, i kraft av å inkorporere aktivkull i den bakteriologiske agar, er Cara ikke avhengig av seriefortynninger av celler og testmiddel.
Den CARA kan bidra til å forutsi bakteriostatisk eller bakteriedrepende virkningen av replikere aktive og bakteriedrepende virkningen av ikke-reproduserende aktive. i gGenerell in, Cara er brukt i parallell med standard MIC 90 analyser. Den prediktive kraften i CARA kommer fra sammenligne MIC 90 og resultater CARA (figur 2 og tabell 1). Når den brukes til å studere anti-mycobakterielle midler, kan Cara nøyaktig forutsi aktiviteten som replikerer bakteriedrepende (figur 4a), replikere bakteriostatisk (figur 4b), ikke-reproduserende baktericid (figur 4c), eller dobbel aktiv (figur 4d). Den CARA tillater også enkel evaluering av en forbindelses aktivitet på tvers av både dose og tid. CFU-analyser alene krever mye arbeid og materiale for å vurdere aktiviteten av en forbindelse over et vidt område av doser og tidspunkter, men oppgaven blir overkommelig når CARA resultater begrense det område av betingelser for slike hvor forbindelsen er beviselig aktiv (Figur 5 ).
Mens Cara har anvendelse i å studere virkningen av enNTI infeksjons på mykobakterier, har analysen begrensninger. Den CARA har et smalt dynamisk område (2-3 log 10), og kan ikke være egnet for forholdene der man forventer det kan ikke være mer enn 2-3 log 10 bakteriell drepe. CARA spådommer krever videre studier ved hjelp av en mer stringent og nøyaktig metode for å telle bakterietall, for eksempel en CFU analysen. Den post-antibiotisk effekt av enkelte antiinfektiva som PAS, kan forvirre CARA som en prediktiv verktøy for å skille mellom forbindelser med bakteriedrepende og bakteriostatisk aktivitet mot replikere M. tuberculosis 7.
Det er to anbefalinger for å bedre kvaliteten på CARA. Først må man helle CARA mikroplater raskt før de agar størkner, og samtidig opprettholde volumetrisk nøyaktighet og å unngå sprut utenfor mikrobrønnene. Uavhengig av antall plater som kreves, anbefaler vi å lage 0,5 til 1 L grupper av medium for å opprettholde medium i flytende form i løpet av den tid som kreves for å helle platene. Endre tips ofte mens du fyller mikro med medium unngår å bruke delvis tilstoppede tips. For det andre må man redusere kunstig variasjon i fluorescens mellom replikater. Mykobakterielle mikrokolonier, særlig for patogene mykobakterier slik som M. tuberculosis, ofte blir uberegnelig. For eksempel kan mikrokolonier som vokser på agaroverflaten variere i størrelse, form, høyde, eller kan strekke seg opp til de indre vegger av mikroplatebrønner. En utfordring er å dekke alle basiller jevnt med utviklings reagens. Et annet hinder er at etter forlenget inkubering ved 37 ° C, kan det faste bakteriologiske medium av Cara mikroplater blir tørr og utsatt for å absorbere det fremkallende reagens. Siden aktivt kull kan binde resazurin og slukke fluorescensen 7, kan det være godt-til-brønn variasjon på grunn av tørre brønner absorbere den resazurin fremkallingsløsningen og det aktiverte Charcoal slukke resazurin fluorescens. Pre-fukte overflaten av alle CARA mikroplate brønnene med PBS umiddelbart før du legger den tredje reagent demper begge disse problemene - utviklings reagent vil nå alle mykobakterielle kolonier likt, og resazurin forblir trygt over aktivt kull. Den CARA kan ha programmer i å identifisere og karakterisere fenotyper av mykobakterielle mutanter, eller i medium-throughput drug discovery-analyser for andre bakteriearter.
Det er ingen interessekonflikter å avsløre.
Vi er takknemlige for Kristin Burns-Huang for sakkyndig vurdering av manuskriptet og J. David Warren (Weill Cornell Medical College) for kjemi assistanse mens utvikle CARA. Dette arbeidet ble støttet av TB Drug Accelerator Program av Bill og Melinda Gates Foundation, Abby og Howard P. Milstein Program i translasjonell medisin, og en NIH TB Research Unit (U19 AI111143). Avdeling for mikrobiologi og immunologi støttes av William Randolph Hearst Foundation. SSK ble støttet av NIH stipend K08AI108799.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
BSA, heat shock | Roche | 3118958001 | |
activated charcoal | Sigma | C5510 | |
PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
tween 80 | Sigma | P8074 | |
tyloxapol | Sigma | T8761 | |
sodium nitrite | Sigma | 2252 | |
rifampicin | Sigma | R3501 | |
6-bromo-1H-indazol-3-amine | Alfa Aesar | H34095 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
magnesium sulfate, heptahydrate | Sigma | M1880 | |
ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
zinc sulfate, heptahydrate | Sigma | Z0251 | |
ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
butyric acid, liquid | Sigma | B103500 | |
resazurin powder | Sigma | R7017 | |
sodium chloride | J.T. Baker | 4058-01 | |
prepared resazurin solution | Invitrogen | DAL1100 | |
PCR stickers | Denville | B1212-5 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | M5 | |
96-well, tissue culture treated microplates | Corning | 3595 | |
reagent reservoirs | VWR | 89094-678 | |
resealable plastic bags | VWR | 395-94602 | |
14 mL Polypropylene round-bottom tubes | Corning | 352059 | |
50 mL conical centrifuge tube | Corning | 352070 | |
75 cm2 Cell culture flask | Corning | 431464U | |
clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate | Costar | 3595 | |
Prism 6 for OS X | GraphPad | http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved