Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.
Há uma necessidade urgente de descobrir e progredir anti-infecciosos que encurtam a duração do tratamento da tuberculose (TB). Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, é refractário à quimioterapia rápida e duradoura, devido à presença de bacilos que exibem resistência a drogas fenotípica. O c harcoal um gar r esazurin um ssay (CARA) foi desenvolvido como uma ferramenta para caracterizar moléculas ativas descobertos por campanhas de rastreio de alto rendimento contra replicar e não replicante M. tuberculosis. Inclusão de carvão activado em meio agar bacteriologic ajuda a atenuar o impacto do composto carry-over, e elimina a exigência de células antes da mancha em CARA microplacas pré-diluir. Após um período de incubação de 7-10 dias a 37 ° C, a redução da resazurina por microcolônias micobacterianas que crescem na superfície de poços CARA permite semi-quantitativa assessment do número de bactérias através de fluorometria. O CARA detecta aproximadamente 2-3 log 10 diferença no número de bactérias e prevê uma concentração bactericida mínima levando a ≥99% a morte bacteriana (MBC ≥99). A CARA ajuda a determinar se uma molécula está activa em bacilos que estão a replicar, não replicantes, ou ambos. experiências piloto utilizando o CARA facilitar a identificação de qual a concentração de agente de teste e o tempo de exposição ao composto requerem avaliação adicional por meio de ensaios de formação de colónias (CFU) da unidade. Além disso, o CARA pode prever se replicar são activos bactericida ou bacteriostático.
Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, podem sobreviver em um host em um estado latente que é refractário à erradicação antibiótico. Fenotípica (não-genética) resistência da M. tuberculosis durante a infecção se acredita ser devido, em parte, às populações de bacilos não replicantes 1,2. Classe persistentes I exibem resistência aos medicamentos fenotípica surgem através de mecanismos estocásticos rara entre grandes populações de células sensíveis a drogas 3,4. persistentes de classe II são tornados não-replicante por fatores de imunidade do hospedeiro, incluindo tensões externas em microambientes encontrados durante a infecção. Desenvolvemos recentemente um modelo in vitro de Classe II não replicante persistência para imitar as condições confrontados por M. tuberculosis em macrófagos activados e granulomas. O modelo multi-stress de Classe II persistência inclui condições que o crescimento lento, tal como uma fonte de carbono do ácido gordo, e completamente Halcrescimento T, tal como acidez suave (pH 5,0), hipoxia (1% de O2), e o óxido nítrico e outros intermediários reactivos de azoto 5-9. Triagem em larga escala empregando este modelo multi-stress de não-replicação, e outros modelos não-replicantes Classe II, rendeu diversas moléculas cuja actividade é dirigida contra o Estado não replicante 5-7,9-18. As mesmas telas não replicantes também revelou uma categoria de moléculas que possuem atividade contra bacilos de multiplicação e não replicantes, denominado "dual ativos" 7,10,12,19,20.
Descoberta de drogas anti-bacteriana na fase de hit-to-lead implica extensa caracterização de moléculas candidatas para escolher leads para a expansão hit, caracterização farmacológica preliminar, a identificação do alvo, e estudos preliminares de eficácia in vivo. Como passo inicial, anti-infecciosos são classificados por seu mecanismo bacteriostático ou bactericida de ação e, se bactericida, wmorte bacteriana hether é tempo e / ou dependente da concentração. O ensaio de formação de colónias unidade (CFU) é o método padrão clássico, ouro para abordar estas questões. No ensaio de CFU, as bactérias são expostas a um agente de teste, após o que se alíquotas são removidas, diluídas em série, e aliquotas de diluições são espalhadas em meio bacteriológico sólida e incubados para permitir o crescimento de células sobreviventes. Finalmente, as colónias bacterianas são enumerados. O ensaio de CFU requer um grande número de placas de microtitulação para diluir as células de petri e placas contendo agar para enumerar colónias sobreviventes. O ensaio CFU para lenta micobactérias de crescimento é prejudicado por seu tempo lento geração (18-24 h), o que requer cerca de 3 semanas para que as colónias a aparecer em placas. Além disso, o espaço da incubadora é muitas vezes limitada em especializados biossegurança de nível-3 instalações.
Enquanto pesado, ensaios de CFU são o padrão de ouro para caracterizar o impacto das moléculas não-replicantes e dual-ativos na mycobacterI a. Ensaios não replicantes são sujeitos a altas taxas de falso-positivos como muitos são acoplados a replicação de ensaios para avaliar a viabilidade celular 6-8. Por exemplo, um composto que tem uma actividade potente contra a replicação de M. tuberculosis (um "replicar activo") pode falhar para matar durante o ensaio não replicante, e ainda assim pode matar em virtude da transição a partir da fase de não reprodução do ensaio para a fase de recuperação do ensaio, que é conduzida em condições que suportam a replicação ( "replicar condições"). Composto transitar complica ainda mais a análise de moléculas ativas dupla, tornando-se difícil distinguir se a atividade foi replicar, não replicantes, ou duplo.
Para resolver os problemas descritos acima, foi desenvolvido o c harcoal um gar r esazurin um ssay (CARA) para uma rápida contagem, semi-quantitativa de espécies de micobactérias tais como M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. smegmatis e 7 (Figuras 1 e 2). Em soluções tampão in vitro, carvão activado sequestra rapidamente a maioria das drogas convencionais utilizadas no tratamento da tuberculose 7. O carvão ativado em CARA microplacas liga compostos que podem transportar mais de uma microplaca de ensaio, e esta característica da CARA elimina a necessidade de diluir em série conteúdos ensaio bem antes de enumeração 7,21,22. O número de microcolónias micobacterianos sobre a superfície de agar de CARA microplacas é estimada pela adição de resazurina, um corante azul, cuja forma reduzida, resorufina, é uma molécula de rosa, cuja fluorescência é medida por espectrofotometria de um 23. CARA microplacas são incubadas durante 1-2 dias de M. smegmatis e de 7-10 dias para as micobactérias de crescimento lento, tais como M. tuberculosis e M. bovis BCG. O CARA tem uma faixa dinâmica estreita do ~ 2-3 log 10 diferência em CFU. Quando usado em vez de um ensaio CFU, uma única microplaca CARA substitui cerca de cinco placas de 96 poços utilizados para diluições em série e as placas de agar 120 tri-estilo utilizados para o chapeamento. Interpretação dos dados CARA ajuda a orientar estudos posteriores, determinando que a incubação tempos e concentrações de compostos para testar em ensaios baseados em CFU mais trabalhoso.
1. Preparação de microplacas CARA
2. Configurar Replicar e Não-replicante MIC 90 Assays
3. A inoculação de CARA Microplates
4. Desenvolver CARA Microplates
Análise 5. Os dados
CARA resultados antecipados estão descritos na Figura 2 e resumidos na Tabela 1. Para as células replicar, o CARA é executado em paralelo com um padrão de MIC 90 ensaios, e para ensaios não-replicante, o CARA é executado em paralelo com um ensaio MIC 90 adaptada que é acoplado a uma fase conseqüência. A concentração de agente de teste que resulta em falha de Cara-de fluorescência a subir acima dos níveis de fundo é a cara-MBC ≥99 (Figura 3a). O "≥99" subscrito indica que a cara-MBC proporciona uma concentração estimada de agente de teste que dá origem a ≥2 log10 morte bacteriana (≥99% de mortes).
O ensaio líquido caldo MIC 90 é incapaz de distinguir entre atividade bactericida e bacteriostática e esta distinção tem de ser resolvido por um ensaio CFU. Deconvenção, o limite que distingue bactericida da atividade bacteriostática para slow-micobactérias de crescimento é de cerca de 2-3 log 10 mortes causadas por 7 dias 7,26. Uma vez que a faixa dinâmica da CARA também é 2-3 log de 10 mortes, o CARA pode fornecer uma estimativa da atividade bactericida ou bacteriostático. A CARA facilmente identifica alguns agentes activos de replicação como bacteriostática devido a falha destes compostos para diminuir CARA fluorescência para os níveis de fundo (Figura 2). No entanto, alguns compostos com actividade bacteriostática contra M. tuberculosis replicar ter um efeito pós-antibiótico potente, o que significa que eles continuam a inibir novo crescimento de bactérias durante a fase de recuperação, mesmo na ausência do composto de reporte. Este efeito pode ser difícil reconhecer no ensaio CARA. Os compostos são suspeitos de exercer um efeito pós-antibiótico se eles exibem uma "janela estática", definida como uma mudança> 4 vezes para a direita entrn as curvas MIC e Cara (Figura 3b). A janela estático indica que uma molécula activa contra a replicação de M. tuberculosis podem ser bacteriostáticos em vez de bactericida. Em alguns casos, as janelas estáticas são aparentes apenas após a inspeção de um eixo Y expandida para CARA fluorescência (Figura 3c e 3d).
90 Cara e dados de MIC são geralmente representados graficamente em conjunto (Figura 4). Os dados representativos para moléculas replicating- e não replicantes-activos testados por MIC 90 e Cara são mostrados na Figura 4. Existem 4 grandes classes de actividade de moléculas: 1) replicando bactericida (demonstradas com isoniazida, Figura 4a); 2) replicação bacteriostático (demonstrado com linezolida, Figura 4b); 3) não replicar bactericida (demonstrado com oxifenbutazona, Figura 4c); e, 4) repbactericida licating-activo (bacteriostáticos ou bactericidas) e não replicante (demonstrado com PA-824, Figura 4D). Importante, as Figuras 4A e 4B demonstram que enquanto a isoniazida e linezolida parecem ter actividade contra bactérias não replicantes pelo ensaio MIC 90, o CARA sugere que eles são inactivos sob as condições não-replicante testados. Para testar a utilidade da CARA predizendo o impacto tempo e dependente da concentração de uma molécula, replicando M. smegmatis foi exposta a concentrações crescentes de rifampicina (Figuras 5a - d), e em vários momentos entre 1-24 horas, as alíquotas foram manchados em placas de Cara. Estes dados indicaram que a rifampicina exercido um impacto tão cedo quanto de 1 hora (figura 5a), apresentado o aumento da actividade bactericida entre 3 e 24 horas (figuras 5B-d), e matou ≥2-3 log 10 em ~ 10 ug / ml, por dois4 h (Figura 5D). Uma experiência semelhante testando quadruplicado de um veículo de controlo e 9 as concentrações de droga, e em 4 pontos de tempo, seriam proibitivos por um ensaio padrão baseado em CFU.
Assim, o CARA tem um papel na descoberta de drogas como um meio-débito, mecanismo rápido para identificar um perfil de actividade da molécula. previsões CARA devem ser rigorosamente avaliados utilizando um ensaio CFU padrão. A adição de 0,4% de carvão activado para placas de Petri para a análise de CFU pode ajudar a melhorar a correlação de dados de cara, e pode resultar em contagens de CFU mais precisos, a magnitude da correcção sendo geralmente proporcional à potência do composto 21,22.
Figura 1: O CARA é uma ferramenta preditiva na descoberta de medicamentos. Este diagrama resume a utilidade do CARA como umestágio intermediário entre a seleção da droga (screening ponto único, cherry-picking e ensaios de dose-resposta) e ensaios demoradas hit-to-lead (ensaios de UFC ea identificação do alvo). [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação esquemática do ensaio em caldo MIC 90 e Cara com os resultados esperados. Ambos os MIC 90 e Cara resultados são apresentados para 8 actividades possíveis. A codificação de cores para MIC 90 poços é branco (sem crescimento) e marrom (crescimento), e para CARA microplacas é preto (ausência de fluorescência) e rosa (fluorescência resorufina). Os dados são hipotéticas. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Especializada termos Cara e definições. A concentração bactericida mínima de uma molécula que resulta em níveis de fluorescência de fundo CARA é a cara-MBC ≥99 (a). Sob condições de replicação, um deslocamento ≥4 vezes da cara-≥99 MBC para a direita da MIC 90 geralmente indica actividade bacteriostática e é chamada uma "janela estática" (b). Para moléculas com um efeito pós-antibiótico potente, janelas estáticos podem ser difíceis de observar, (c) e requeremexpansão do eixo Y (CARA fluorescência) para visualizar (d). Os dados são hipotéticas. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: MIC ilustrativa 90 e CARA resultados para selecionar compostos. Dados para o MIC 90 (vermelho) e Cara (azul) são demonstradas por (uma) isoniazida (INH), (b) linezolida, (c), oxifenbutazona, e (d) PA-824. De tipo selvagem de M. tuberculosis H37Rv foi exposta aos compostos durante 7 dias sob condições de replicação padrão ou o modelo multi-stress de não replicação 7-9. MIC 90 e Cara ensaios foram realizados como se mostra na Figura 2. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 20157]Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: dose e actividade dependente do tempo de rifampicina. O não-patogénico, de crescimento rápido M. smegmatis foi exposta a concentrações crescentes de rifampicina sob condições de replicação e alíquotas foram amostrados para Cara em 1 (a), 3 (b), 6 (c) e 24 (d) h. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7].com / files / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Resumo dos resultados esperados na Figura 2. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
O CARA foi originalmente desenvolvido para aliviar um gargalo no progredindo não replicantes ou moléculas dual-ativo 7. A CARA serve como um passo intermédio entre a confirmação de concentração-resposta de visitas de rastreio primário e ensaios de CFU (Figura 1). Uma vez que uma única placa CARA pode substituir inúmeras placas de microtitulação necessárias para preparar diluições em série e placas de Petri contendo ágar utilizado para enumerar bactérias sobreviventes, o CARA fornece um meio simples de avaliar rapidamente a atividade de um molécula e testar múltiplas variáveis de uma só vez, incluindo concentração de composto e tempo de exposição ao composto.
Num ensaio de CFU, além de diluições em série, que muitas vezes variam até 10 vezes de 6, a placa de agar tipicamente dilui moléculas por um ~ 800 vezes adicional (10 ul Onto 8 ml numa placa de Petri de estilo de tri). Nosso em duas fases, ensaio de triagem multi-stress para compostos ativos na não-replicante M. tuberculosis tem um factor de transição de 5 vezes, isto é, um composto presente no estágio de não reprodução do ensaio está presente a um quinto da concentração original no (replicação) da fase de ensaio 6-9 excrescência. Os atenua CARA carry-over efeitos sequestrando moléculas pequenas com carvão ativado. A maioria dos medicamentos contra a tuberculose e candidatos clínicos ligam carvão activado rapidamente e completamente, com a excepção do aminoglicósido estreptomicina 7. Inclusão de carvão ativado em placas de agar para ensaios CFU impedido inibição do crescimento bacteriano, ou morte bacteriana, por realizadas-over TMC207 e PA-824 7,21,22. Assim, em virtude de incorporação de carvão activado no ágar bacteriológico, o CARA não é dependente de diluições em série de células e agente de teste.
O CARA pode ajudar a prever o impacto bacteriostático ou bactericida de replicar ativos e impacto bactericida de ativos não-replicante. em geral, o CARA é usado em paralelo com o MIC padrão 90 ensaios. O poder preditivo da CARA vem comparando MIC 90 e os resultados CARA (Figura 2 e Tabela 1). Quando usadas para estudar agentes anti-micobacterianos, a CARA pode prever com precisão a actividade bactericida que está a replicar (Figura 4a), replicando bacteriostático (Figura 4b), bactericida não replicante (Figura 4C), ou dupla activa (Figura 4d). O CARA também permite avaliação simples da actividade de um composto através tanto da dose e do tempo. Os ensaios de CFU por si só requerem uma grande quantidade de esforço e de material para avaliar a actividade de um composto sobre uma ampla gama de doses e tempos, mas a tarefa torna-se controlável quando resultados CARA limitar a gama de condições para aquelas em que o composto é demonstravelmente activa (Figura 5 ).
Enquanto o CARA tem utilidade no estudo da acção de umNTI-infecciosos em micobactérias, o ensaio tem limitações. A CARA tem uma gama dinâmica estreita (3/2 log 10) e pode não ser apropriado para as condições em que se antecipa que não pode ser mais do que 2 a 3 log 10 morte bacteriana. previsões CARA requerem estudos adicionais utilizando um método mais rigoroso e preciso para enumerar os números bacterianos, tais como um ensaio de CFU. O efeito pós-antibiótico de alguns anti-infecciosos, tais como PAS, pode confundir o CARA como uma ferramenta preditiva para distinguir entre compostos com actividade bactericida e bacteriostática contra M. tuberculosis replicar 7.
Há duas recomendações para melhorar a qualidade da CARA. Primeiro, é preciso derramar CARA microplacas rapidamente antes que os solidifica de ágar, mantendo a precisão volumétrica e evitar espirrar fora de micropoços. Independentemente do número de placas necessárias, recomendamos que 0,5 a 1 L de meio de lotes para ajudar a manter o médio na forma líquida para a duração do tempo requerido para placas de verter. Trocando as pontas com frequência durante o preenchimento microplacas com meio evita usar dicas parcialmente obstruídas. Em segundo lugar, deve-se minimizar a variabilidade artifactual na fluorescência entre repetições. Microcolônias micobacterianas, em particular para micobactérias patogénicas, tais como M. tuberculosis, muitas vezes crescem de forma irregular. Por exemplo, microcolônias que crescem na superfície de agar podem variar em tamanho, a forma, a altura, ou pode estender-se para as paredes interiores dos poços das microplacas. Um desafio é cobrir todos os bacilos uniformemente com o reagente em desenvolvimento. Outro obstáculo é que após incubação prolongada a 37 ° C, o meio bacteriológico sólido da CARA microplacas pode tornar-se seca e propenso a absorção do reagente revelador. Desde carvão activado pode ligar-se resazurina e extinguir a fluorescência 7, pode haver uma variação poço-a-poço devido a poços secos absorvem a resazurina e a solução de revelação Charcoa activadal têmpera resazurina fluorescência. Pré-molhar a superfície de todos os poços da microplaca CARA com PBS imediatamente antes de adicionar o reagente de desenvolvimento de mitiga ambos estes problemas - o reagente de desenvolvimento vai chegar a todas as colónias de micobactérias da mesma forma, e a resazurina permanece segura acima do carvão activado. O CARA pode ter aplicações na identificação e caracterização de fenótipos dos mutantes de micobactérias, ou de médio rendimento ensaios de descoberta de drogas para outras espécies bacterianas.
Não há conflitos de interesse para divulgar.
Somos gratos a Kristin Burns-Huang para análise de peritos do manuscrito e J. David Warren (Weill Cornell Medical College) para obter ajuda química durante o desenvolvimento da CARA. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Accelerator TB Drogas da Fundação Bill e Melinda, a Abby e Howard Programa P. Milstein em Translational Medicine, e um TB Unidade de Investigação NIH (U19 AI111143). O Departamento de Microbiologia e Imunologia é suportado pelo Randolph Hearst Fundação William. SSK foi apoiada por K08AI108799 concessão NIH.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
BSA, heat shock | Roche | 3118958001 | |
activated charcoal | Sigma | C5510 | |
PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
tween 80 | Sigma | P8074 | |
tyloxapol | Sigma | T8761 | |
sodium nitrite | Sigma | 2252 | |
rifampicin | Sigma | R3501 | |
6-bromo-1H-indazol-3-amine | Alfa Aesar | H34095 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
magnesium sulfate, heptahydrate | Sigma | M1880 | |
ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
zinc sulfate, heptahydrate | Sigma | Z0251 | |
ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
butyric acid, liquid | Sigma | B103500 | |
resazurin powder | Sigma | R7017 | |
sodium chloride | J.T. Baker | 4058-01 | |
prepared resazurin solution | Invitrogen | DAL1100 | |
PCR stickers | Denville | B1212-5 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | M5 | |
96-well, tissue culture treated microplates | Corning | 3595 | |
reagent reservoirs | VWR | 89094-678 | |
resealable plastic bags | VWR | 395-94602 | |
14 mL Polypropylene round-bottom tubes | Corning | 352059 | |
50 mL conical centrifuge tube | Corning | 352070 | |
75 cm2 Cell culture flask | Corning | 431464U | |
clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate | Costar | 3595 | |
Prism 6 for OS X | GraphPad | http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved