Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.
Существует острая необходимость, чтобы обнаружить и прогрессировать антибактериальные, которые сокращают продолжительность туберкулеза (ТБ) лечения. Микобактерии туберкулеза, этиологическим агентом туберкулеза, является резистентной к быстрому и прочному химиотерапии в связи с наличием микобактерий , проявляющих фенотипической устойчивости к лекарственным средствам. С harcoal гар R esazurin в ssay (CARA) был разработан в качестве инструмента для характеристики активных молекул , обнаруженных высокопроизводительного скрининга кампании против репликации и не тиражирование микобактерии. Включение активированного угля в бактериологической агаровой среде помогает смягчить воздействие соединения, переносимых и устраняет необходимость предварительно разбавить клеток перед пятнистость на CARA микропланшетов. После инкубационного периода 7-10 дней при температуре 37 ° С, снижение резазурин по микобактерий микроколониями растущих на поверхности CARA стрипы позволяет полуколичественного Ассssment бактериальных чисел через флуориметрии. КАРА обнаруживает примерно 2-3 log 10 разницы в бактериальных чисел а и предсказывает минимальную бактерицидную концентрацию , ведущую к ≥99% бактериального убийства (MBC ≥99). КАРА помогает определить, активен ли на бацилл, которые копируют, не-тиражирование, или как молекула. Пилотные эксперименты с использованием Cara облегчить идентификацию которых концентрация тестируемого агента и времени соединения экспозиции требуют дальнейшей оценки колониеобразующих единиц (КОЕ) анализов. Кроме того, КАРА может предсказать, если тиражирование активные вещества обладают бактерицидным или бактериостатическим.
Микобактерии туберкулеза, этиологическим агентом туберкулеза, может выжить в хозяине в латентном состоянии , что не поддается ликвидации антибиотиков. Фенотипическая (Негенетические) сопротивление микобактерий туберкулеза во время инфекции , как полагают, объясняется, в частности, для населения , не являющихся тиражирование бацилл 1,2. Класс persisters I отображающие фенотипическую устойчивость к лекарству возникают с помощью редких стохастических механизмов среди крупных популяций наркотиков чувствительных клеток 3,4. persisters класса II оказываются не-тиражирование факторами иммунитета хозяина, в том числе внешних напряжений в микросреды, возникающих во время инфекции. Недавно мы разработали модель ин витро класса II , не тиражирование настойчивости , чтобы имитировать условия , с которыми сталкивается микобактерий туберкулеза в активированных макрофагах и гранулемы. Мульти-стресс модель класса II включает в себя условия настойчивостью, что медленный рост, такие как источник углерода жирных кислот, и полностью галрост т, такие как мягкая кислотность (рН 5,0), гипоксию (1% O 2) и оксида азота и других химически активных промежуточных продуктов азота 5-9. Крупномасштабное скрининг с использованием этого мульти-стресс модель не-репликации, а также другие модели , не Дублирование класса II, дала разнообразные молекулы, деятельность которых направлена против не-тиражирование состояния 5-7,9-18. Те же не-тиражирование экраны также выявили категорию молекул , которые обладают активностью против обоих тиражирование и не тиражирование бацилл, называемые "двойные" 7,10,12,19,20 активные вещества.
Антибактериальная открытия препарата в фазе хит-к-свинца влечет за собой обширную характеристику молекул - кандидатов на выбор потенциальных клиентов для расширения хит, предварительной фармакологической характеризации, идентификации мишени и предварительных исследований эффективности в естественных условиях. В качестве первого шага, Противомикробные препараты классифицируются по их бактериостатическим или бактерицидным механизмом действия и, если бактерицидным, шhether бактериальная убийство требует больших затрат времени и / или зависит от концентрации. Блок колониеобразующих (КОЕ) анализ является классическим, золотой стандартный метод для решения этих вопросов. В анализе КОЕ, бактерии подвергаются воздействию тестируемого агента, после чего аликвоты, серийно разведенной, и аликвоты разбавлений распространяются на твердой среде бактериологическим и инкубировали, чтобы обеспечить рост выживших клеток. Наконец, бактериальные колонии перечислены. Анализ КОЕ требует большого количества титрационных микропланшетов для разбавления клеток и агар-содержащего чашках пластины для перечисления выживших колоний. Анализ КОЕ для медленно растущей микобактерий препятствует их медленное время генерации (18-24 ч), что требует около 3 недель колонии появиться на планшетах. Кроме того, инкубатор пространство часто ограничено в специализированных биологической безопасности на уровне 3-объектов.
Хотя громоздким, КОЕ анализы являются золотым стандартом, чтобы охарактеризовать влияние, не реплицируются и двойного активных молекул на mycobacterНМА. Номера реплицирующиеся анализы подвержены высоким ложноположительных как многие связаны с репликацией анализов для оценки клеточного 6-8 жизнеспособности. Например, соединение , которое обладает сильной активностью против репликации микобактерии (а "тиражирование активный") может не убить в течение не-тиражирование анализе, тем не менее все еще может убить в силу переносимых из не-тиражирование фазы из анализ на этапе восстановления анализа, который проводится в условиях, которые поддерживают репликацию ( "тиражирование условия"). Соединение переносятся еще более усложняет анализ дуальной активных молекул, что делает его трудно отличить, была ли активность репликации, не-тиражирование или спаренными.
Для решения проблем , описанных выше, мы разработали гр harcoal в Гар г esazurin на ssay (CARA) для быстрого, полуколичественного перечисление видов микобактерий , таких как М. tuberculОсис, М. Бови BCG и М. smegmatis 7 (1 и 2). В буферных растворах в пробирке, активированный уголь быстро изолирует большинство стандартных препаратов , используемых для лечения туберкулеза 7. Активированный уголь в CARA микропланшетов связывает соединения , которые могут переносятся из анализа микропланшет, и эта особенность CARA исключает требование серийно разбавить содержание анализа задолго до перечислению 7,21,22. Количество микобактерий микроколониями на агаризованной поверхности CARA микропланшетов оценивается путем добавления резазурин, синий краситель, чья восстановленную форму, резоруфином, является розовой молекулой, измеряют флуоресценцию с помощью спектрофотометрии 23. КАРА микропланшеты инкубируют в течение 1-2 дней для M. smegmatis и 7-10 дней для медленно растущих микобактерий , таких как микобактерии туберкулеза и M. Bovis БЦЖ. КАРА имеет узкий динамический диапазон ~ 2-3 log 10 сиситемахключение контакта в КОЕ. При использовании вместо анализа КОЕ, один КАРА микропланшет заменяет примерно пять 96-луночных планшетов, используемых для серийных разведений и чашках с агаром 120 три- стилей, используемых для покрытия. Интерпретация данных CARA помогает направлять последующие исследования, определяя, какие Инкубационный раз и концентрации соединений для тестирования в более трудоемкие анализы КОЕ на основе.
1. Приготовление CARA микропаншет
2. Настройка Репликация и Non-тиражирование MIC 90 Assays
3. Посев CARA микропаншет
4. Развитие CARA микропаншет
5. Анализ данных
Ожидаемые результаты Cara описаны на рисунке 2 и приведены в таблице 1. Для репликации клеток, то выполняется КАРА параллельно со стандартными МИК 90 анализов, и для не-тиражирование анализах КАРА выполняется параллельно с адаптированной MIC 90 анализа , который соединен с нарост фазой. Концентрация тестируемого агента , что приводит к выходу из строя чара-флуоресценции подняться выше фоновых уровней является КАРА-MBC ≥99 (рис 3а). "≥99" нижний индекс указывает на то, что КАРА-MBC обеспечивает расчетную концентрацию тестируемого агента , что приводит к ≥2 log 10 бактериального Kill (≥99%) убийств.
Жидкий бульон MIC 90 анализа не в состоянии различать бактерицидной и бактериостатической активности и это различие должно быть решена с помощью анализа КОЕ. ОтКонвенция, порог , который отличает бактерицидным от бактериостатической активности для медленно растущих микобактерий составляет примерно 2-3 log 10 убийств в течение 7 дней 7,26. Так как динамический диапазон CARA также 2-3 log 10 убийств, то КАРА может дать оценку бактерицидной или бактериостатической активности. КАРА легко идентифицирует некоторые реплицирующиеся активные вещества как бактериостатическое из - за отказа этих соединений для уменьшения CARA флуоресценции до фоновых уровней (рисунок 2). Тем не менее, некоторые соединения с бактериостатической активностью против тиражирования микобактерии имеют сильный эффект после антибиотик, а это означает , что они по- прежнему тормозят возобновление роста бактерий во время фазы восстановления даже при отсутствии соединения перенесенных. Этот эффект может быть трудно признать в анализе CARA. Соединения подозреваются оказывают эффект после антибиотик, если они показывают "статическое окно", определяется как> 4-кратный сдвиг вправо betweeп кривые MIC и Cara (рис 3b). Статическое окно указывает на то, что молекула активного против тиражирования микобактерии может быть бактериостатическим вместо бактерицидным. В некоторых случаях, статические окна являются очевидными только после проверки расширенного Y-оси для CARA флуоресценции (фиг.3С и 3D).
Cara и MIC 90 данных обычно наносятся вместе (рисунок 4). Типичные данные для replicating- и не-тиражирование-активных молекул испытанных MIC 90 и CARA показаны на рисунке 4. Есть 4 основных классов активности для молекул: 1) тиражирование бактерицидным (продемонстрированные с изониазидом, рис 4а); 2) тиражирование бактериостатическое (продемонстрировано с линезолида, рис 4б); 3) не-тиражирование бактерицидным (продемонстрировано с оксифенбутазон, рис 4в); и, 4) Replicating-активные (бактериостатическое или бактерицидное) и не тиражирование бактерицидное (продемонстрирована PA-824, рис 4г). Важно отметить, что цифры 4а и 4б показывают , что в то время как изониазид и линезолид , по всей видимости , обладают активностью против не-тиражирование бактерий с помощью анализа MIC 90, то КАРА предполагает , что они являются неактивными при несв тиражирование условиях испытания. Чтобы проверить полезность CARA в прогнозировании затрат времени и зависимое от концентрации повреждений , наносимых молекулы, тиражирование M. smegmatis подвергалось возрастающих концентраций рифампицина (фиг.5а - d), и в разное время между 1-24 ч, аликвот наносили на CARA пластин. Эти данные свидетельствуют о том, что рифампицин оказали влияние еще 1 ч (рис 5а), отображается возрастающую бактерицидную активность от 3 до 24 ч (рис 5б-г), и убил ≥2-3 log 10 на ~ 10 мкг / мл на 24 ч (рис 5г). Аналогичный эксперимент тестирования quadruplicates элемента управления транспортного средства и 9 концентрации лекарственного средства, а также в 4 временных точках, будут непомерно стандартным КОЕ на основе анализа.
Таким образом, КАРА играет определенную роль в открытии препарата в качестве средней пропускной способности, быстрый механизм для идентификации профиль активности в молекуле. предсказания Cara следует тщательно оценить с помощью стандартного КОЕ анализа. Добавление 0,4% активированного угля в чашках Петри для анализа КОЕ может помочь улучшить корреляцию с данными CARA, и может привести к более точных подсчетов КОЕ, величина коррекции , как правило, пропорциональна потенции жилого 21,22.
Рисунок 1: КАРА является прогностическим инструментом обнаружения наркотиков. Эта диаграмма обобщает полезность CARA в виде непромежуточная стадия между скрининга лекарственных средств (скрининг одной точки, вишня сбора и анализов доза-реакция) и хит-на-свинца анализов затратных по времени (КОЕ анализов и идентификации мишени). [Адаптировано с разрешения Gold и др., Противомикробные агенты и Химиотерапия, 2015 7] Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схема анализа бульона MIC 90 и CARA с ожидаемыми результатами. Оба MIC 90 и Cara результаты представлены на 8 возможных мероприятий. Цветовое кодирование для MIC 90 стрипы белый (отсутствие роста) и коричневый (рост), так и для CARA микропланшетов не является черным (без флуоресценции) и розовый (резоруфином флуоресценция). Данные носят гипотетический характер. [Адаптировано с разрешения Gold и др., Противомикробные агенты и Химиотерапия, 2015 7] Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Специализированные Cara термины и определения. Минимальная бактерицидная концентрация молекулы , что приводит к фоновых уровней CARA флуоресценции является КАРА-MBC ≥99 (а). При реплицирующимися услови х ≥4-кратный сдвиг чара-MBC ≥99 справа от МИК 90 часто указывает бактериостатической активностью и называется "статическое окно" (б). Для молекул с мощным эффектом после антибактериальной, статические окна может быть трудно наблюдать (с) и требуютрасширение Y-оси (КАРА флуоресценции) для визуализации (d). Данные носят гипотетический характер. [Адаптировано с разрешения Gold и др., Противомикробные агенты и Химиотерапия, 2015 7] Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Иллюстративное MIC 90 и КАРА результаты для некоторых соединений. Данные для MIC 90 (красный) и КАРА (голубой) демонстрируются на примере (а) изониазид (INH), (б) линезолида, (с) оксифенбутазон, и (г) PA-824. Дикого типа туберкулез M. H37Rv подвергалось соединений в течение 7 дней в стандартных условиях тиражирование и модели нескольких напряжений не-репликации 7-9. MIC 90 анализы и КАРА были выполнены , как показано на рисунке 2. [Адаптировано с разрешения Gold и др., Противомикробные агенты и Химиотерапия, 20157]Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: дозы и времени зависит от активности рифампицина. Непатогенные, быстрорастущие M. smegmatis подвергалось возрастающие концентрации рифампицина при реплицирующимися условиях и аликвоты отбирали для CARA на 1 (а), 3 (б), 6 (с) и 24 (d) ч. [Адаптировано с разрешения Gold и др., Антимикробные агенты и химиотерапией, 2015 7].com / файлы / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Сводка ожидаемых результатов на рисунке 2. [Адаптировано с разрешения Gold и др., Противомикробные агенты и Химиотерапия, 2015 7] Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
КАРА был первоначально разработан , чтобы облегчить узкое место в прогрессирующей не-тиражирование или спаренными активных молекул 7. КАРА служит промежуточным шагом между подтверждения ответа от концентрации первичных обращений скрининга и КОЕ анализа (рисунок 1). Так как один КАРА пластина может заменить множество микротитрационных планшетов, необходимые для подготовки серийных разведений, и агар-содержащих чашки Петри, используемые для перечисления оставшихся в живых бактерий, то КАРА предоставляет простые средства для быстрой оценки активности молекуле и протестировать несколько переменных одновременно, в том числе концентрации соединения и время воздействия соединения.
В анализе КОЕ, в дополнение к серийных разведений , которые часто дальность до 10 6 -кратно, чашки с агаром , как правило , разжижает молекул дополнительным ~ 800 раз (10 мкл на 8 мл в три-стиле чашку Петри). Наш двухступенчатый, мульти-стресс скрининг тест для соединений , действующих на не-тиражирование М. Tuberculosis имеет коэффициент уровня переносимых в 5 раз, то есть соединение , которое присутствует в не тиражирование стадии анализа присутствует на одну пятую от исходной концентрации в выроста (тиражирования) фазы анализа 6-9. В Cara смягчают последствия унос эффектов улавливание малых молекул с активированным углем. Большинство противотуберкулезных препаратов и клинических кандидатов Bind активированный уголь быстро и полностью, за исключением аминогликозидов стрептомицин 7. Включение активированного угля в чашки с агаром для КОЕ анализов предотвратить бактериальное ингибирование роста или бактериальный убийство, по переносимого TMC207 и ПА-824 7,21,22. Таким образом, в силу включения активированного угля в бактериологическим агаром, то КАРА не зависит от серийных разведений клеток и тестируемого агента.
КАРА может помочь предсказать бактериостатическое или бактерицидное воздействие реплицирующимися активов и бактерицидного воздействия недействующих активов тиражирование. В гбщая, то КАРА используется параллельно со стандартным MIC 90 анализов. Предсказательная сила CARA исходит из сравнения MIC 90 и результатов CARA (рисунок 2 и таблицу 1). При использовании для изучения анти-микобактерий агентов, то КАРА может точно предсказать активность, тиражирование бактерицидное (рис 4а), тиражирование бактериостатическое (рисунок 4б), не-тиражирование бактерицидное (рисунок 4в) или двойной активный (рисунок 4г). КАРА также допускает простую оценки деятельности жилого комплекса через обе дозы и времени. КОЕ анализы в одиночку требуют много усилий и материала для оценки активности соединения в широком диапазоне доз и времени, но задача становится управляемой , когда результаты Cara сузить диапазон условий, в которых соединение является доказуемо активным (Рисунок 5 ).
В то время как КАРА имеет полезность в изучении действиеНТИ-препараты на микобактерии, анализ имеет свои ограничения. КАРА имеет узкий динамический диапазон (2-3 log 10) и может не подходить для условий , в которых один предвосхищает не может быть больше , чем от 2 до 3 log 10 бактериальная убийство. Cara прогнозы требуют дальнейшего изучения с использованием более строгого и точный метод для перечисления числа бактерий, таких как КОЕ анализа. Эффект после антибиотиком некоторых антибактериальных, таких как PAS, может сбить с толку Cara в качестве интеллектуального инструмента различать между соединениями с бактерицидной и бактериостатической активностью в отношении репликации микобактерии 7.
Есть две рекомендации по улучшению качества CARA. Во-первых, нужно залить Cara микропланшетов быстро перед агара затвердевает, сохраняя при этом объемную точность и избежать разбрызгивания за пределы лунках. Независимо от количества пластин, мы рекомендуем сделать 0,5 до 1 л порций среды, чтобы помочь сохранить мedium в жидкой форме для продолжительности времени, необходимого для разлить в чашки. Изменение советы часто при заполнении микропланшетов со средой, используя частично избегает забитые советы. Во-вторых, необходимо свести к минимуму изменчивость следов искусственной флуоресценции между повторами. Микобактериальные микроколонии, в частности для патогенных микобактерий , таких как микобактерии туберкулеза, часто растут хаотично. Например, микроколонии, растущие на поверхности агара могут различаться по размеру, форме, высоте, или может простираться до внутренних стенок лунки микропланшета. Одна из проблем заключается, чтобы охватить все бациллы равномерно проявляющего реагента. Другим препятствием является то, что после того, как длительной инкубации при 37 ° C, твердое вещество бактериологическое среде CARA микропланшетов может стать сухой и склонной к поглощающие проявляющий реагент. Так как активированный уголь может связывать ресазурин и гасят флуоресценцию 7, могут быть вариации хорошо в скважине из - за сухих скважин поглощающие резазурин разработки раствора и активированного Charcoaл тушение флуоресценции ресазурин. Предварительное смачивание поверхности всех КАРА стрипы с PBS непосредственно перед добавлением проявляющий реагент уменьшает обе эти проблемы - проявляющий реагент достигнет все микобактериальные колонии в равной степени, и ресазурина остается безопасно над активированным углем. КАРА может иметь применение в идентификации и характеристике фенотипы мутантов микобактерий, или в средней пропускной способности обнаружения наркотиков анализов для других видов бактерий.
Там нет конфликта интересов по раскрытию информации.
Мы благодарны Кристин Бернс-Хуан на экспертизу рукописи и Дж Дэвид Уоррен (Weill Cornell Medical College) для помощи химии при разработке Cara. Эта работа была поддержана ускорительной программе лекарственным препаратам против туберкулеза Фонда Билла и Мелинды Гейтс, Эбби и Говарда программы P. Milstein в трансляционной медицины, а также исследовательское подразделение NIH ТБ (U19 AI111143). Отдел микробиологии и иммунологии поддерживается Херст Foundation. ССК была поддержана NIH грант K08AI108799.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
BSA, heat shock | Roche | 3118958001 | |
activated charcoal | Sigma | C5510 | |
PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
tween 80 | Sigma | P8074 | |
tyloxapol | Sigma | T8761 | |
sodium nitrite | Sigma | 2252 | |
rifampicin | Sigma | R3501 | |
6-bromo-1H-indazol-3-amine | Alfa Aesar | H34095 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
magnesium sulfate, heptahydrate | Sigma | M1880 | |
ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
zinc sulfate, heptahydrate | Sigma | Z0251 | |
ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
butyric acid, liquid | Sigma | B103500 | |
resazurin powder | Sigma | R7017 | |
sodium chloride | J.T. Baker | 4058-01 | |
prepared resazurin solution | Invitrogen | DAL1100 | |
PCR stickers | Denville | B1212-5 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | M5 | |
96-well, tissue culture treated microplates | Corning | 3595 | |
reagent reservoirs | VWR | 89094-678 | |
resealable plastic bags | VWR | 395-94602 | |
14 mL Polypropylene round-bottom tubes | Corning | 352059 | |
50 mL conical centrifuge tube | Corning | 352070 | |
75 cm2 Cell culture flask | Corning | 431464U | |
clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate | Costar | 3595 | |
Prism 6 for OS X | GraphPad | http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved