Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.
Det finns ett akut behov av att upptäcka och framsteg mot infektioner som förkortar varaktigheten av tuberkulos (tbc) behandling. Mycobacterium tuberculosis, det etiologiska medlet för TB, är refraktär till snabb och varaktig kemoterapi på grund av närvaron av baciller som uppvisar fenotypisk resistens. C harcoal hete r esazurin en ssay (CARA) utvecklades som ett verktyg för att karakterisera aktiva molekyler som upptäckts av high-throughput screening kampanjer mot replikering och icke replikerande M. tuberculosis. Införande av aktivt kol i bakteriologisk agarmedium hjälper till att minska effekterna av föreningen carry-over, och eliminerar kravet att i förväg späda celler före observation på CARA mikroplattor. Efter en 7-10 dagars inkubationsperiod vid 37 ° C, minskning av resazurin av mykobakteriella mikrokolonier som växer på ytan av CARA brunnarna tillåter semikvantitativ assessment av bakterie tal via fluorometri. CARA upptäcker ungefär en 2-3 log 10 skillnad i bakterieantal och förutspår en minimal baktericid koncentration leder till ≥99% bakteriedöd (MBC ≥99). CARA bidrar till att avgöra huruvida en molekyl är verksamt på baciller som är replikerande, icke-replikerande, eller båda. Pilotförsök med hjälp av CARA underlätta identifieringen av vilken koncentration av testmedlet och tid för förening exponering kräver ytterligare utvärdering av kolonibildande enhet (CFU) analyser. Dessutom kan CARA förutsäga om repliker aktiva är bakteriedödande eller bakteriostatiskt.
Mycobacterium tuberculosis, det etiologiska medlet för tuberkulos, kan överleva i en värd i en latent tillstånd som är behandlingsresistenta mot antibiotika utrotning. Fenotypisk (icke-genetiska) motstånd av M. tuberculosis under infektion tros bero delvis på populationer av icke replikerande baciller 1,2. Klass I persisters visar fenotypisk resistens uppstår via sällsynta stokastiska mekanismer bland stora populationer av läkemedelskänsliga celler 3,4. Klass II persisters görs icke-replikerande av faktorer av värdimmunitet, inklusive externa spänningar i mikromiljöer som uppstått under infektion. Vi utvecklade nyligen en modell av klass II in vitro icke-replikerande uthållighet för att efterlikna förhållanden konfronteras av M. tuberculosis i aktiverade makrofager och granulom. Multi-stress modell av klass II persistens inkluderar tillstånd att långsam tillväxt, såsom en fettsyra kolkälla, och helt halt tillväxt, såsom mild surhet (pH 5,0), hypoxi (1% O2), och kväveoxid och andra reaktiva kvävemellanprodukter 5-9. Storskalig screening utnyttjar denna multi-stress modell av icke-replikation, och andra klass II icke-replikerande modeller, har gett olika molekyler vars verksamhet är riktad mot icke-replikerande tillstånd 5-7,9-18. Samma icke replikerande skärmar visade också en kategori av molekyler som besitter aktivitet mot både replikerande och icke-replikerande baciller, kallas "dubbla aktiva" 7,10,12,19,20.
Antibakteriella läkemedelsutveckling i träffen till bly fas innebär omfattande karakterisering av kandidatmolekyler för att välja ledare för hit expansion, preliminär farmakologisk karakterisering, mål identifiering och preliminära in vivo effektivitetsstudier. Som ett tidigt skede, är anti-infektioner klassificeras efter deras bakteriostatiska eller bakteriedödande verkningsmekanism och om bakteriedödande, whether bakteriedöd är tids- och / eller koncentrationsberoende. Den kolonibildande enhet (CFU) analys är det klassiska, guld standardmetod för att ta itu med dessa frågor. I CFU-analysen, är bakterier exponeras för ett testmedel, varefter alikvoter avlägsnas, serieutspäddes och portioner av utspädningar sprids på fast bakteriologisk medium och odlades för att möjliggöra tillväxt av överlevande celler. Slutligen är bakteriekolonier räknades. CFU-analysen kräver ett stort antal mikrotiterplattor för att späda cellerna och agar-innehållande Petriplattor för att räkna upp överlevande kolonier. CFU-analysen för långsamt växande mykobakterier hämmas av sin långsamma generationstid (18-24 timmar), vilket kräver ungefär tre veckor för kolonier att synas på plattor. Dessutom är inkubatorn utrymme ofta begränsad i specialiserade biosäkerhet-nivå-3 anläggningar.
Även besvärliga, CFU analyser är guldmyntfoten för att karakterisera effekterna av icke-replikerande och dubbla aktiva molekyler på mycobacteria. Icke-replikerande analyser är föremål för höga falskt positiva värden som många är kopplade till replikera analyser för att bedöma cellulär viabilitet 6-8. Till exempel, en förening som har en potent aktivitet mot replikera M. tuberculosis (ett "replikerande aktiv") kan misslyckas med att döda under icke-replikerande analys, men kan fortfarande döda på grund av överföring från den icke-replikerande fasen av analys för att återhämtningsfasen av analysen, som genomförs under förhållanden som stödjer replikation ( "replikerande förhållanden"). Förening föra över ytterligare komplicerar analys av dubbla aktiva molekyler, vilket gör det svårt att skilja på om aktiviteten replikera, icke-replikerande, eller dubbel.
Att ta itu med de problem som beskrivs ovan, har vi utvecklat c harcoal hete r esazurin en ssay (CARA) för snabb, semi-kvantitativ uppräkning av mykobakteriella arter såsom M. tuberculOsis, M. bovis BCG och M. smegmatis 7 (fig 1 och 2). I buffertlösningar in vitro snabbt binder aktivt kol flesta vanliga läkemedel som används för att behandla tuberkulos 7. Aktivt kol i CARA mikro binder föreningar som kan föra över från en analysmikro, och denna egenskap hos CARA eliminerar kravet att seriellt späda analysbrunn innehåll före uppräkning 7,21,22. Antalet mykobakteriella mikrokolonier på agarytan av CARA mikroplattor uppskattas genom tillsats av resazurin, ett blått färgämne, vars reducerade formen, resorufin, är en rosa molekyl vars fluorescens mäts av en spektrofotometri 23. CARA mikro inkuberas under 1-2 dagar för M. smegmatis och 7-10 dagar för långsamt växande mykobakterier såsom M. tuberculosis och M. bovis BCG. CARA har ett smalt dynamiskt område av ~ 2-3 log 10 differens i CFU. När de används i stället för en CFU-analys, ersätter en enda CARA mikroplatta cirka fem 96-brunnars plattor används för seriella spädningar och 120 tri-stil agarplattor användes för plätering. Tolkning av CARA data hjälper vägleda efterföljande studier genom att bestämma vilka inkubation gånger och föreningskoncentrationer för att testa mer mödosamma CFU-baserade analyser.
1. Framställning av CARA Mikro
2. Installera Replikera och icke repliker MIC 90 Analyser
3. Inokulering av CARA Mikro
4. Utveckling av CARA Mikroplattor
5. Dataanalys
Förväntade CARA Resultaten beskrivs i fig 2 och sammanfattas i Tabell 1. För att replikera celler, är CARA löpa parallellt med en standard MIC 90-analyser, och för icke-replikerande analyser, är CARA löpa parallellt med en anpassad MIC 90 analys som är kopplad till en utväxt fas. Koncentrationen av testmedlet som resulterar i ett misslyckande av CARA-fluorescens för att höja sig över bakgrundsnivåer är CARA-MBC ≥99 (figur 3a). Den "≥99" index indikerar att CARA-MBC ger en uppskattad koncentration av testagens som ger upphov till ≥2 log 10 bakteriedöd (≥99% avdödning).
Den flytande buljong MIC 90 analysen kan inte skilja mellan bakteriedödande och bakteriostatisk aktivitet och denna skillnad måste lösas genom en CFU-analys. Avkonvention, den tröskel som skiljer bakteriedödande från bakteriostatisk aktivitet för långsamt växande mykobakterier är cirka 2-3 log 10 dödade under 7 dagar 7,26. Eftersom det dynamiska omfånget av CARA är också 2-3 log 10 döda, kan CARA ge en uppskattning av bakteriedödande eller bakteriostatisk aktivitet. CARA identifierar lätt en del replikerande aktiva som bakteriostatiska på grund av fel hos dessa föreningar att minska CARA fluorescens bakgrundsnivåerna (Figur 2). Men vissa föreningar med bakteriostatisk aktivitet mot replikera M. tuberculosis har en potent efter antibiotisk effekt, vilket innebär att de fortsätter att hämma återväxt av bakterier under återhämtningsfasen, även i frånvaro av föreningen carry-over. Denna effekt kan vara svårt att känna igen i CARA-analysen. Föreningar misstänks utöva en post-antibiotisk effekt om de visa en "statisk fönster", definierad som en> 4-faldig förskjutning åt höger between MIC och CARA kurvorna (figur 3b). Den statiska fönstret visar att en molekyl aktiv mot replikera M. tuberculosis kan vara bakteriostatisk stället för bakteriedödande. I vissa fall, statiska fönstren är uppenbara först efter inspektion av en utökad Y-axeln för CARA fluorescens (Figur 3c och 3d).
CARA och MIC 90 data vanligen plottas tillsammans (Figur 4). Representativa data för replicating- och icke-replikerande aktiva molekyler som testats av MIC 90 och CARA visas i figur 4. Det finns 4 stora verksamhetsgrupper för molekyler: 1) replikera bakteriedödande (demonstrerats isoniazid, figur 4a); 2) repliker bakteriostatisk (visat med linezolid, figur 4b); 3) icke-replikerande bakteriedödande (visat med oxifenbutazon figur 4c); och, 4) replicating-aktiv (bakteriostatiska eller bakteriedödande) och icke-replikerande bakteriedödande (visat med PA-824, figur 4d). Viktigare, Figurerna 4a och 4b visar att medan isoniazid och linezolid tycks ha aktivitet mot icke-replikerande bakterier genom att MIC 90-analysen föreslår CARA de är inaktiva på de icke-replikerande testade betingelser. För att testa användbarheten av CARA att förutsäga en molekylens tids- och koncentrationsberoende effekt, replikerar M. smegmatis utsattes för ökande koncentrationer av rifampicin (figurerna 5a - d), och vid olika tidpunkter mellan 1-24 timmar, alikvoter fläckig på CARA plattor. Dessa data indikerade att rifampicin utövade en effekt så tidigt som en timme (Figur 5a), som visas ökar bakteriedödande aktivitet mellan 3 och 24 timmar (Fig 5b-d), och dödade ≥2-3 log 10 vid ~ 10 mikrogram / ml med 24 h (figur 5d). Ett liknande experiment testar kvadruplikat av en fordonskontroll och 9 läkemedelskoncentrationer, och vid 4 tidpunkter, skulle bli oöverkomliga med en standard CFU-baserad analys.
Således har CARA en roll i läkemedelsforskning som medium genomströmning, snabb mekanism för att identifiera en molekyl verksamhet profil. CARA förutsägelser bör noggrant utvärderas med hjälp av en vanlig CFU-analys. Tillsatsen av 0,4% aktivt kol till petriskålar för CFU-analys kan bidra till att förbättra korrelation till CARA data och kan leda till mer exakta CFU räknas, storleken på korrigeringen i allmänhet är proportionell mot föreningens potens 21,22.
Figur 1: CARA är ett förutsägande verktyg inom läkemedelsforskning. Diagrammet sammanfattar användbarheten av CARA som enmellansteg mellan läkemedelsscreening (enda screening, plocka russinen ur kakan, och dos-responsanalyser) och tidskrävande hit-till-bly-analyser (CFU analyser och mål identifiering). [Anpassad med tillstånd från Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk bild av buljongen MIC 90 analys och CARA med förväntade resultat. Både MIC 90 och CARA resultaten presenteras för 8 möjliga aktiviteter. Den färgkodning för MIC 90 brunnarna är vit (ingen tillväxt) och brun (tillväxt), och för CARA mikro är svart (ingen fluorescens) och rosa (resorufin fluorescens). Data är hypotetiska. [Anpassad med tillstånd från Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Specialiserade CARA termer och definitioner. Den minimala baktericida koncentrationen av en molekyl som resulterar i bakgrundsnivåer av CARA fluorescens är den CARA-MBC ≥99 (a). Under replikerande betingelser, en ≥4-faldig förskjutning av CARA-MBC ≥99 till höger om MIC 90 indikerar ofta bakteriostatisk aktivitet och som kallas en "statisk fönster" (b). För molekyler med en potent post-antibiotisk effekt, kan statiska fönster vara svårt att observera (c) och kräverexpansion av Y-axeln (Cara fluorescens) för att visualisera (d). Data är hypotetiska. [Anpassad med tillstånd från Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Belysande MIC 90 och CARA resultat för utvalda föreningar. Data för MIC 90 (röd) och CARA (blå) påvisas för (a) isoniazid (INH), (b) linezolid, (c) oxifenbutazon, och (d) PA-824. Vild-typ M. tuberculosis H37Rv utsattes för föreningar under 7 dagar under standardreplikerande förhållanden eller multi-stress modell av icke-replikation 7-9. MIC 90 analyser och CARA utfördes såsom visas i Figur 2. [Anpassad med tillstånd från Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 20157]Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: dos- och tidsberoende aktiviteten av rifampicin. Den icke-patogena, snabbväxande M. smegmatis utsattes för ökande koncentrationer av rifampicin under repliker förhållanden och alikvoter provtas för CARA vid ett (a), 3 (b), 6 (c) och 24 (d) h. [Anpassad med tillstånd från Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7].com / filer / ftp_upload / 54.690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Sammanfattning av förväntade resultaten i figur 2. [Anpassad med tillstånd från Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Klicka här för att se en större version av denna tabell.
CARA utvecklades ursprungligen för att lindra en flaskhals i skrider icke-replikerande eller dubbla aktiva molekyler 7. CARA fungerar som ett mellansteg mellan koncentrations-respons bekräftelse av primär screening träffar och CFU-analyser (Figur 1). Eftersom en enda CARA platta kan ersätta ett flertal mikrotiterplattor som krävs för att förbereda serieutspädningar och agar innehållande petriskålar används för att räkna överlevande bakterier ger CARA ett enkelt sätt att snabbt bedöma en molekyl aktivitet och testa flera variabler samtidigt, inklusive föreningskoncentration och tid för exponering för föreningen.
I en CFU-analys, förutom seriespäd som ofta sträcker sig upp till 10 6-faldigt, späder agarplattan typiskt molekyler av en ytterligare ~ 800-faldig (10 pl på 8 ml i en tri-stil Petri platta). Våra två steg, multi-stress screeningsanalys för föreningar som verkar på icke-replikerande M. tuberculosis har en överhängs faktor på 5-faldig, det vill säga en förening närvarande i den icke-replikerande steget i analysen är närvarande vid en femtedel den ursprungliga koncentrationen i utväxt (replikerande) fasen av analysen 6-9. CARA minskar carry-over effekter genom att binda små molekyler med aktivt kol. Majoriteten av tuberkulosmedicin och kliniska kandidater binder aktivt kol snabbt och fullständigt, med undantag av aminoglykosiden streptomycin 7. Införande av aktivt kol i agarplattor för CFU-analyser förhindrade bakterietillväxthämning, eller bakteriell döda genom överfört TMC207 och PA-824 7,21,22. Således, på grund av att införliva aktivt kol i bacteriologic agar, är CARA inte beroende av seriespädningar av celler och testmedel.
CARA kan hjälpa förutsäga bakteriostatisk eller bakteriedödande effekten av replikerande aktiva och bakteriedödande effekt av icke-replikerande aktiva. igeneral, CARA används parallellt med standard MIC 90 analyser. Det prediktiva kraften i CARA kommer från en jämförelse MIC 90 och CARA resultat (Figur 2 och Tabell 1). När det används för att studera anti-mykobakterier kan CARA exakt förutsäga aktivitet som replikera bakteriedödande (figur 4a), replikerar bakteriostatiskt (Figur 4b), icke-replikerande bakteriedödande (figur 4c), eller dubbel aktiv (figur 4d). CARA medger också enkel utvärdering av en förenings aktivitet över både dos och tid. CFU analyser kräver enbart en hel del ansträngning och material för att bedöma aktiviteten hos en förening över ett brett spektrum av doser och tider, men uppgiften blir hanterbara när CARA resultat begränsa rad villkor som de i vilka föreningen är bevisligen aktiv (Figur 5 ).
Medan CARA har användbarhet i att studera verkan av enNTI-infektioner på mykobakterier, har analysen begränsningar. CARA har ett smalt dynamiskt område (2-3 log 10) och får inte vara lämpligt för förhållanden där en förutser det kan inte vara mer än 2-3 log 10 bakteriedöd. CARA förutsägelser kräver ytterligare studie med en mer stringent och exakt metod för att räkna antalet bakterier, såsom CFU-analys. Efter antibiotiska effekten av vissa medel mot infektioner, såsom PAS kan förbrylla CARA som en förutsägande verktyg för att skilja mellan föreningar med bakteriedödande och bakteriostatisk aktivitet mot replikera M. tuberculosis 7.
Det finns två rekommendationer för att förbättra kvaliteten på CARA. Först måste en pour CARA mikro snabbt innan agar stelnar, samtidigt som volymetriska noggrannhet och undvika stänk utanför mikro. Oavsett antalet plattor som krävs, rekommenderar vi att 0,5 till 1 L satser av medium för att bidra till att upprätthålla medium i flytande form under hela den tid som krävs för att hälla plattor. Ändra tips ofta när de fyller mikro med medium undviker att använda delvis igensatta tips. För det andra måste man minimera artefaktuella variation i fluorescens mellan replikat. Mykobakteriella mikrokolonier, i synnerhet för patogena mykobakterier såsom M. tuberculosis, växer ofta oförutsägbart. Till exempel kan mikrokolonier som växer på agarytan variera i storlek, form, höjd, eller kan sträcka sig upp till de inre väggarna av brunnarna. En utmaning är att täcka alla baciller jämnt med framkallningsreagens. Ett annat hinder är att efter långvarig inkubation vid 37 ° C, kan den fasta bacteriologic mediet i CARA mikroplattor blir torra och benägna att absorbera framkallningsreagens. Eftersom aktivt kol kan binda resazurin och släcka fluorescens 7, kan det vara väl till brunnar variation som beror på torra brunnar absorberar resazurin framkallningslösningen och den aktiverade Charcoal släckning resazurin fluorescens. Förvätning ytan av alla CARA brunnarna med PBS omedelbart före tillsats av framkallningsreagenset mildrar båda dessa problem - framkallningsreagens kommer att nå alla mykobakteriella kolonier lika, och resazurin förblir säkert ovanför aktivt kol. CARA kan ha tillämpningar i att identifiera och karakterisera fenotyper av mykobakteriella mutanter, eller i medium genomströmning läkemedelsforskning analyser för andra bakteriearter.
Det finns inga intressekonflikter att lämna ut.
Vi är tacksamma för Kristin Burns-Huang för expertgranskning av manuskriptet och J. David Warren (Weill Cornell Medical College) för kemi hjälp samtidigt utveckla CARA. Detta arbete stöddes av Accelerator Program TB drog av Bill och Melinda Gates Foundation, Abby och Howard P. Milstein Program i Translational Medicine, och en NIH TB Research Unit (U19 AI111143). Institutionen för mikrobiologi och immunologi stöds av William Randolph Hearst Foundation. SSK stöddes av NIH bidrag K08AI108799.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
BSA, heat shock | Roche | 3118958001 | |
activated charcoal | Sigma | C5510 | |
PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
tween 80 | Sigma | P8074 | |
tyloxapol | Sigma | T8761 | |
sodium nitrite | Sigma | 2252 | |
rifampicin | Sigma | R3501 | |
6-bromo-1H-indazol-3-amine | Alfa Aesar | H34095 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
magnesium sulfate, heptahydrate | Sigma | M1880 | |
ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
zinc sulfate, heptahydrate | Sigma | Z0251 | |
ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
butyric acid, liquid | Sigma | B103500 | |
resazurin powder | Sigma | R7017 | |
sodium chloride | J.T. Baker | 4058-01 | |
prepared resazurin solution | Invitrogen | DAL1100 | |
PCR stickers | Denville | B1212-5 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | M5 | |
96-well, tissue culture treated microplates | Corning | 3595 | |
reagent reservoirs | VWR | 89094-678 | |
resealable plastic bags | VWR | 395-94602 | |
14 mL Polypropylene round-bottom tubes | Corning | 352059 | |
50 mL conical centrifuge tube | Corning | 352070 | |
75 cm2 Cell culture flask | Corning | 431464U | |
clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate | Costar | 3595 | |
Prism 6 for OS X | GraphPad | http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved