Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.
keşfetmek ve tüberküloz (TB) tedavi süresini kısaltmak anti-enfeksiyon ilerlemeye acil ihtiyaç vardır. Mycobacterium tuberculosis, TB etiyolojik ajan nedeniyle fenotipik ilaç direnci sergileyen basilinin bulunması hızlı ve kalıcı kemoterapiye dirençli. C harcoal bir gar bir ssay (CARA) esazurin r kopyalayan ve M. tüberküloz olmayan kopyalayan karşı yüksek verimli tarama kampanyaları tarafından keşfedilen aktif molekülleri karakterize etmek için bir araç olarak geliştirilmiştir. bakteriyolojik agar ortamında aktif kömür İçerme bileşik carry-over etkisini azaltmaya yardımcı olur ve CARA mikroplitelerin üzerinde tespit önce hücreleri önceden sulandırmak için gereksinimini ortadan kaldırır. 37 ° C 'de 7-10 günlük kuluçka süresinden sonra, CARA mikro levha yüzeyi üzerinde büyüyen mikobakteriyel mikrokoloniler göre resazurin azaltılması yarı-kantitatif asse izinfluorometri ile bakteriyel numaralarının ssment. CARA yaklaşık bakteri sayısı 2-3 log 10 fark tespit eder ve ≥99% bakteriyel öldürücü (MBC ≥99) giden en az bir bakteri öldürücü konsantrasyon öngörür. CARA bir molekül kopyalayan basili olmayan kopyalayan, ya da her ikisi üzerinde etkin olup olmadığını belirlemenize yardımcı olur. CARA'nın kullanarak pilot deneyler Test maddesinin ve bileşiğin maruz kalma süresi konsantrasyonu koloni oluşturucu birim (CFU) tahlilleri ile ileri değerlendirme gerektiren belirlenmesini kolaylaştırır. kopyalayan aktif bakteri ya da bakteriyostatik ise ek olarak, CARA tahmin edebilirsiniz.
Mycobacterium tuberculosis, tüberküloz etyolojik madde, antibiyotik yok edilmesi dirençli olan bir latent halde bir konakçıda yaşayabilir. Enfeksiyon sırasında M. tuberculosis fenotipik (genetik olmayan) direnci replike olmayan basil 1,2 popülasyonları, kısmen, bağlı olduğu düşünülmektedir. Fenotipik ilaç direnci gösteren Sınıf I persisters ilaç duyarlı hücrelerin 3,4 büyük nüfus arasında nadir stokastik mekanizmaları ile ortaya çıkmaktadır. Sınıf II persisters enfeksiyon sırasında karşılaşılan mikroçevrelerde dış gerilmeler de dahil olmak üzere ev sahibi bağışıklık faktörleri, non-kopyalayan işlenir. Son zamanlarda Sınıf II bir in vitro modeli geliştirdik replike olmayan aktive makrofajlar ve granülom M. tuberculosis ile karşı karşıya koşulları taklit etmek için kalıcılık. Sınıf II kalıcılık çok stres modeli bu koşulları içeren bir yağlı asit, karbon kaynağı ve tamamen Hal, yavaş büyüme,Bu, hafif asit (pH 5.0), hipoksi (% 1 O 2) ve nitrik oksit ve diğer reaktif nitrojen ara 5-9 T büyüme. Olmayan çoğaltma bu çok stres modeli kullanan büyük ölçekli tarama ve diğer Sınıf II olmayan kopyalayan modelleri, kimin faaliyeti olmayan kopyalayan devlete 5-7,9-18 yöneltilen çeşitli moleküller vermiştir. Aynı olmayan kopyalayan ekranlar da, kopyalayan ve her ikisi de olmayan kopyalayan basil karşı aktiviteye sahip moleküllerin bir kategori ortaya "ikili aktifleri" 7,10,12,19,20 olarak adlandırılan.
Isabet to-kurşun aşamasında Antibakteriyel ilaç keşif hit genişleme, ön farmakolojik karakterizasyonu, hedef tanımlama ve ön in vivo etkinlik çalışmaları için yol seçmek için aday moleküllerin geniş karakterizasyonu gerektirir. Erken aşama olarak, bir anti-enfektif W, eğer, bakterisidal olarak bunların bakteriostatik veya bakteri öldürücü bir mekanizma ile sınıflandırılır vester bakteriyel öldürmek zaman ve / veya konsantrasyona bağlıdır. koloni oluşturan birim (CFU) tahlil bu soruları yanıtlamak için klasik, altın standart yöntemdir. CFU deneyde, bakteri tümbölenler çıkarıldı seri olarak seyreltilmiş, bundan sonra, bir test maddesi, maruz kalan ve seyreltilmiş numune porsiyonları bir katı bakteriyolojik ortam üzerine yayıldı ve hayatta kalan hücrelerin büyüme için gerekli olan inkübe edilir. Son olarak, bakteri kolonileri numaralandırılır. CFU tahlili kalan koloniler numaralandırmak için hücreleri ve agar içeren Petri plakaları sulandırmak için mikrotiter plakaları çok sayıda gerektirir. yavaş büyüyen mikobakteriler için CFU tahlil koloniler plakalar üzerinde görünmesi için yaklaşık 3 hafta gerektirir onların yavaş nesil zaman (18-24 saat), tarafından engellenmektedir. Ayrıca, inkübatör alanı genellikle özel biyogüvenlik düzeyi-3 tesislerinde sınırlıdır.
hantal birlikte, CFU tahlilleri mycobacter olmayan replike ve çift olarak aktif moleküllerin etkisini karakterize etmek için, altın standartia. Sigara kopyalayan tahlilleri hücresel canlılığı, 6-8 değerlendirmek için deneyleri kopyalayan bağlanır gibi birçok yüksek yalancı pozitiflik oranlarına tabidir. Genel olarak, M. tuberculosis replike karşı güçlü bir aktiviteye sahip olan bir bileşik: (a "etkin kopyalayan") replike olmayan tahlil sırasında öldürmek için başarısız olabilir, ancak yine de replike edici olmayan fazdan carry-over sayesinde öldürebilir çoğaltma ( "koşulları replike") destekleyen şartlar altında yürütülen deney, iyileşme fazına deneyi. Bileşik ayrıca üzerinde taşır aktivite, sigara kopyalayan veya çift kopyalayan olup olmadığını zor ayırt etmek yapım çift aktif moleküllerin analizi zorlaştırmaktadır.
Yukarıda açıklanan sorunları gidermek için, bu tür M. tüberkülozun olarak mikobakteri türlerinin hızlı, yarı-kantitatif sayımı için bir ssay (CARA) esazurin c harcoal bir gar r geliştirdiataklar, M. bovis BCG, ve M. smegmatis 7 (Şekil 1 ve 2). In vitro tampon çözeltiler, aktif kömür hızlı tüberküloz 7 tedavisinde kullanılan standart ilaçlarla en tecrit. Aktive bir tahlil mikroplakadan üzerinde taşıyabilir bileşikleri bağlar mikropleytin CARA kömür ve CARA bu özelliği seri 7,21,22 numaralandırma önce deney kuyu içeriğini sulandırmak için gereksinimini ortadan kaldırır. CARA mikroplakalar agar yüzeyi üzerinde mikobakteriyel mikrokoloniler sayısı resazurin ilavesiyle tahmin edilmektedir olan indirgenmiş bir şekilde, Resorufin bir mavi boya, flüoresan bir spektrofotometri 23 ile ölçülür pembe bir moleküldür. M. smegmatis 1-2 gün ve M. tuberculosis ve M. bovis BCG gibi yavaş gelişen mantar-bakterilere için 7-10 gün boyunca inkübe edilir mikro CARA. CARA ~ 2-3 günlük 10 sorumluluk yönün dar bir dinamik aralığı vardırCFU Rence. Bunun yerine, bir CFU tahlili içinde kullanıldığı zaman, tek bir CARA mikro yaklaşık kaplama için kullanılan seri seyreltileri, 120 üç tür agar plakaları için kullanılan beş, 96 gözlü levhalar yerine geçer. CARA verilerin yorumlanması daha zahmetli CFU bazlı deneylerde test etmek için hangi inkübasyon süreleri ve bileşik konsantrasyonları belirleyerek yapılan araştırmalar kılavuz yardımcı olur.
CARA mikro hazırlanması 1.
90 Deneyleri 2. kopyalama Kurma ve MİK Sigara kopyalayan
CARA mikro 3. İnokülasyon
4. CARA mikropleytin Geliştirme
5. Veri Analizi
Beklenen Cara sonuçları Şekil 2'de tarif edilen ve Tablo 1 'de özetlenmiştir. Hücreleri çoğaltmak için, CARA standart MIC 90 tahlillerinde paralel olarak çalıştırılır ve non-kopyalayan deneyleri için, CARA bir sonucudur faza bağlanır uyarlanmış bir MIC 90 testi ile paralel olarak çalıştırılır. Arka plan seviyelerinin üstünde yükselmeye Cara-floresans başarısızlıkla sonuçlanan deney maddesinin konsantrasyonu, Cara-MBC ≥99 (Şekil 3a). "≥99" indis CARA-MBC ≥2 log 10 bakteri öldürücü (≥99% öldürmek) yol açan test ajanının tahmini konsantrasyonu sağladığını gösterir.
Sıvı suyu MIC 90 tahlil bakterisit ve bakteriostatik aktivite arasında ayrım yapamaz ve bu ayrım CFU tahlili ile çözülmesi gerekir. Tarafındankongre, yavaş büyüyen mikobakteriler için bakteriyostatik faaliyetten bakterisidal ayıran eşik değeri yaklaşık 7 gün 7,26 üzerinde 2-3 günlük 10 öldürme olduğunu. CARA dinamik aralığı da 2-3 günlük 10 öldürmek olduğundan, CARA bakterisidal veya bakteriyostatik aktivitesinin bir tahmin sağlayabilir. CARA nedeniyle kolaylıkla arka plan seviyelerinde Cara floresan azaltmak için, bu bileşiklerin yetmezliği (Şekil 2) bakteriyostatik bazı kopyalayan aktif maddelerini tanımlar. Ancak, M. tuberculosis kopyalayan karşı bakteriyostatik aktivite ile bazı bileşikler bile bileşik taşıma-over yokluğunda iyileşme aşamasında bakteri büyütme inhibe etmeye devam yani güçlü bir post-antibiyotik etkisi vardır. Bu etki CARA tahlilinde fark etmek zor olabilir. Onlar bir "statik pencere" görüntüler varsa bileşikler doğru betwee bir> 4 kat vardiya olarak tanımlanan, bir post-antibiyotik etkisi uygulamakla şüpheleniliyorn MIC ve CARA eğrileri (Şekil 3b). Statik penceresi M. tuberculosis replike karşı aktif bir molekül yerine bakterisidal bakteriostatik olabileceğini gösterir. Bazı durumlarda, statik camlar sadece CARA floresan (Şekil 3c ve 3d) için genişletilmiş bir y-ekseni incelendikten sonra anlaşılacaktır.
CARA ve MIC 90 veriler genellikle birlikte (Şekil 4) çizilmiştir. MIC 90 Cara test replicating- ve replike olmayan aktif moleküller için Örnek veriler, Şekil 4'te gösterilmiştir. Moleküller için 4 büyük etkinlik sınıfı vardır: 1) bakterisidal çoğaltılıyor (Şekil 4a, izoniazid ile gösterdi); 2) kopyalayan bakteriyostatik (linezolid, Şekil 4b) ile gösterilmiştir; 3) olmayan kopyalayan bakteri (oksifenilbütazon, Şekil 4c) ile gösterilmiştir; ve, 4) temsilcisi(PA-824, Şekil 4d ile gösterilen) licating aktif (bakteriostatik veya bakteri öldürücü) ve non-replike bakteri. Önemli olarak, 4a Şekiller izoniazid ve linezolid MIC 90 yöntemi ile replike olmayan bakterilere karşı etkinliğe sahip olduğu görünürken, CARA da test replike olmayan koşullar altında aktif olmayan göstermektedir göstermek 4b. (Şekil 5a - d) rifampisin artan konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır, M. smegmatis replike bir molekülün zaman ve konsantrasyona bağımlı bir etki tahmin Cara yararlı test için ve 1-24 saat arasında, çeşitli zamanlarda, tümbölenler lekeli CARA plakalar üzerine. Bu veriler, rifampisin, erken 1 saat (Şekil 5A) gibi bir etki sarf 3 ve 24 saat (Şekil 5b-d) arasındaki artan bakterisidal aktivitesi gösterdiğini göstermiştir ve 2 ile ~ 10 ug / ml ≥2-3 log 10 öldürüldü4 saat (Şekil 5d). Benzer bir deney, bir vasıta kontrolü ile 9 ilaç konsantrasyonlarının dörtlü test ve 4 zaman noktalarında, standart bir CFU-bazlı deney ile neredeyse imkansız olur.
Böylece, CARA bir molekülün aktivite profili tanımlamak için bir orta verimlilik, hızlı bir mekanizma olarak ilaç keşfi bir role sahiptir. CARA tahminleri titizlikle standart CFU tahlili kullanılarak değerlendirilmelidir. CFU analizi için Petri plakaları% 0.4 aktif kömür ilave CARA veri ilişki iyileştirmeye yardımcı olabilir, ve düzeltme büyüklüğü genel olarak bileşiğin etki gücüne 21,22 orantılıdır daha doğru CFU sayımlarında neden olabilir.
Şekil 1: CARA ilaç keşfi bir öngörü araçtır. Bu şema, bir olarak CARA yararını özetlemektedirilaç taraması (tek nokta tarama, kiraz toplama ve doz-yanıt deneyleri) ve zaman alıcı isabet to-kurşun deneyleri (CFU tahlilleri ve hedef tanımlama) arasındaki ara aşama. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 2015 7] Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: beklenen sonuçlarla suyu MIC 90 tahlil ve CARA şematik. Hem MİK 90 ve CARA sonuçları 8 olası faaliyetler için sunulmuştur. Renk kodlama MIC 90 mikroplaka kuyuları için (hiç büyüme) ve kahverengi (büyüme) beyaz ve CARA için mikropleytin (hiçbir floresan) ve pembe (Resorufm floresan) siyahtır. Veriler varsayımsal vardır. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 2015 7] Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: CARA terim ve tanımları İhtisas. CARA floresan arka plan seviyeleri ile sonuçlanan bir molekül minimum bakteri öldürücü konsantrasyon Cara-MBC ≥99 (a). Kopyalayan koşullar altında, MIC 90 sağında Cara-MBC ≥99 bir ≥4 kat kaydırma genellikle bakteriyostatik etkinlik gösterir ve bir "statik penceresi", (b) olarak adlandırılır. Güçlü bir post-antibiyotik etkisi ile moleküller için, statik pencere gözlemlemek (c) ve gerektiren zor olabilirY ekseni (CARA floresan) genişleme (d) görselleştirmek için. Veriler varsayımsal vardır. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 2015 7] Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Örnek MIC 90 Cara seçilmiş bileşikleri için sonuçları. MIC 90 (kırmızı) ve CARA (mavi) için veri (a) izoniazid (INH), (b) linezolid, (c) oksifenilbütazon, ve (d) PA-824 için gösterilmiştir. Yabani tip M.tüberküloz H37Rv, standart replike koşulları ya da olmayan çoğaltma 7-9 çoklu gerilme modeli altında 7 gün boyunca bileşiklere maruz bırakıldı.Şekil 2'de gösterildiği gibi, MIC 90 deneyler Cara yapıldı. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 20157]Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: doza ve rifampisin zamana bağlı aktivitesi. Patojenik olmayan, hızlı büyüyen M. smegmatis replike koşulları ve alikotları altında rifampisin artan konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır Cara için örneklendi 1 (a), 3 (b) 6 (c) ve 24 (d) 'sa. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal ajanlar ve Kemoterapi 2015 7].com / files / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: Şekil 2'de beklenen sonuçlarının özeti. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 2015 7] Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
CARA aslen olmayan kopyalayan veya çift aktif molekülleri 7 ilerleyen bir darboğaz hafifletmek için geliştirilmiştir. CARA primer tarama lan ve CFU tahlilleri (Şekil 1) konsantrasyon-yanıt teyidi arasındaki bir ara ürün olarak hizmet vermektedir. Tek bir CARA plaka kalan bakterileri numaralandırmak için kullanılan seri dilüsyonları hazırlamak için gerekli sayıda mikrotiter plakaları ve agar içeren Petri plakaları yerine beri, CARA hızla molekülün aktivitesini değerlendirmek ve bileşik konsantrasyonunda da dahil olmak üzere bir defada birden çok değişken, test etmek için basit bir araç sağlar ve bileşik maruz kalma süresi.
CFU tahlili içinde, çoğu zaman 10 6 kat ye kadar seri seyreltiler ek olarak, agar, tipik olarak ek ~ 800-kat (tri tarzı Petri plakası 8 ml üzerinde 10 ul) molekülleri seyreltir. Aktif bileşikler için iki aşamalı, çoklu baskı görüntüleme deneyi M. TU replike olmayantüberküloz tahlilinde replike edici olmayan aşamada bir bileşik mevcut beşte büyümesinin deneyinde 6-9 arasında (replike) aşaması orijinal konsantrasyonda bulunur, yani, 5-kat bir şekilde bir faktör vardır. CARA azaltan carry-over etkileri aktif kömür ile küçük moleküller tecrit yoluyla. Tüberküloz ilaç ve klinik adaylar çoğunluğu 7 streptomisin aminoglikosit dışında, hızlı bir şekilde ve tam olarak aktif kömür bağlar. CFU tahlilleri agar plakalarında aktif kömür dahil edilmesiyle bakteriyel gelişme inhibisyonu ve bakteriyel öldürmek engellenmiş taşınan üzerinde TMC207'ye ve PA-824 7,21,22. Bu nedenle, bakteriyolojik agar aktif kömür içeren sayesinde CARA hücreler ve test maddesinin seri seyreltmeleri bağımlı değildir.
CARA kopyalayan aktif ve olmayan kopyalayan aktiflerle bakterisidal etkisi bakteriostatik veya bakterisidal etkisini tahmin yardımcı olabilir. genel CARA standart MIC 90 tahlillerinde paralel olarak kullanılır. CARA tahmin gücü MIC 90 ve CARA sonuçları (Şekil 2 ve Tablo 1) karşılaştırarak gelir. Anti-mikobakteriyel maddeler çalışma kullanıldığında CARA doğru bakteriyostatik (Şekil 4b), replike olmayan bakterisidal (Şekil 4C), veya çift olarak aktif (Şekil 4D), çoğaltma, bakteri (Şekil 4a) replike olup aktivitesi tahmin edebilirsiniz. Cara aynı dozda ve sürede, her iki arasında bir bileşiğin etkinliğinin basit değerlendirilmesini sağlar. CFU tahlilleri yalnız doz ve zamanlarda geniş bir yelpazede üzerinde bir bileşiğin aktivitesini değerlendirmek için çaba ve bir sürü malzeme gerektiren, ancak CARA sonuçları olanlara koşulları aralığını daraltmak zaman görev (bileşik kanıtlanabilir aktif olduğu Şekil 5 yönetilebilir hale ).
CARA bir eylem okuyan yardımcı olsa damikobakteriler üzerinde nti-enfektif, tahlil sınırlamaları vardır. CARA dar bir dinamik aralık (2-3 log 10) sahiptir ve bir 2'den fazla 10 günlük 3 bakteriyel öldürmek olmayabilir öngörüyor hangi koşullar için uygun olmayabilir. CARA tahminleri bir CFU tahlili gibi bakteri sayıları, numaralandırmak için daha sıkı ve doğru bir yöntem kullanarak, daha fazla çalışma gerektirir. Böyle PAS gibi bazı anti-enfeksiyon, post-antibiyotik etkisi, M. tuberculosis 7 kopyalayan karşı bakterisit ve bakteriostatik aktiviteye sahip bileşiklerin ayırt etmek bir öngörü aracı olarak CARA'nın karıştırabilir.
Cara kalitesini artırmak için iki öneriler vardır. hacimsel doğruluk korumak ve mikro dışında sıçramasını kaçınarak Birincisi, bir, mikroplaklar hızla agar katılaşır önce CARA'nın dökmek gerekir. Ne olursa olsun gerekli plakaların sayısı, biz m korumaya yardımcı olmak için orta 0,5 ile 1 L toplu yapmanızı öneririzlevhalar dökmek için gereken zaman süresince sıvı formda edium. kısmen tıkalı ipuçlarını kullanarak kaçınır orta mikropleytin doldururken sık sık ipuçları değiştirilmesi. İkincisi, bir çoğaltır arasındaki floresan artefakt değişkenliği en aza indirmek gerekir. Mikobakteriyel mikrokoloniler, örneğin M. tuberculosis gibi patojenik mikobakteri özellikle de, genellikle düzensiz büyür. örneğin, agar yüzeyi üzerinde büyüyen mikrokoloniler boyut, şekil, yüksekliği değişebilir ya da mikro levha iç duvarlarına kadar uzanabilir. Bir meydan okuma madde ile eşit tüm basil karşılamaktır. Bir başka engel, 37 ° C de, uzun süreli kuluçkadan sonra CARA mikroplakalar katı bakteriyolojik ortamı dönüştürücü madde emici kuru ve yatkın hale olmasıdır. Aktif kömür resazurin bağlamak ve floresan 7 gidermek beri nedeniyle çözüm geliştirme resazurin emici kuru kuyu ve aktif Charcoa iyi-to-kuyu varyasyon olabilirl söndürme resazurin ışık vermiştir. Gelişmekte olan reaktif eşit tüm mikobakteriyel koloniler ulaşacak ve resazurin aktif kömür üzerinde güvenle kalır - Ön ıslatma hemen gelişmekte ayıracı eklemeden önce PBS ile tüm CARA mikroplak kuyuların yüzeyini bu sorunların her ikisi de azaltır. CARA belirlenmesi ve veya diğer bakteri türleri için orta verimli ilaç keşfi deneylerinde mikobakteriyel mutant fenotipleri karakterize uygulamalara sahip olabilir.
ifşa hiçbir çıkar çatışması vardır.
Biz el yazması ve kimya yardımı J. David Warren (Weill Cornell Medical College) CARA'nın geliştirirken uzman inceleme için Kristin Burns-Huang müteşekkiriz. Bu eser Translational Medicine Bill ve Melinda Gates Vakfı, Abby ve Howard P. Milstein Programı TB İlaç Hızlandırıcı Programı ve NIH TB Araştırma Birimi (U19 AI111143) tarafından desteklenmiştir. Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü William Randolph Hearst Vakfı tarafından desteklenmektedir. SSK NIH hibe K08AI108799 tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
BSA, heat shock | Roche | 3118958001 | |
activated charcoal | Sigma | C5510 | |
PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
tween 80 | Sigma | P8074 | |
tyloxapol | Sigma | T8761 | |
sodium nitrite | Sigma | 2252 | |
rifampicin | Sigma | R3501 | |
6-bromo-1H-indazol-3-amine | Alfa Aesar | H34095 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
magnesium sulfate, heptahydrate | Sigma | M1880 | |
ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
zinc sulfate, heptahydrate | Sigma | Z0251 | |
ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
butyric acid, liquid | Sigma | B103500 | |
resazurin powder | Sigma | R7017 | |
sodium chloride | J.T. Baker | 4058-01 | |
prepared resazurin solution | Invitrogen | DAL1100 | |
PCR stickers | Denville | B1212-5 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | M5 | |
96-well, tissue culture treated microplates | Corning | 3595 | |
reagent reservoirs | VWR | 89094-678 | |
resealable plastic bags | VWR | 395-94602 | |
14 mL Polypropylene round-bottom tubes | Corning | 352059 | |
50 mL conical centrifuge tube | Corning | 352070 | |
75 cm2 Cell culture flask | Corning | 431464U | |
clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate | Costar | 3595 | |
Prism 6 for OS X | GraphPad | http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved