Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Häufige Probleme bei der Verarbeitung von biologischen Proben für Beobachtungen mit dem Rasterelektronenmikroskop (SEM) umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Mit jungen Blütengewebe, oomycete Zysten und Pilzsporen (Agaricales) als Beispiele spezielle Protokolle empfindliche Proben zu verarbeiten hier beschrieben werden, die einige der wichtigsten Herausforderungen in der Probenbehandlung für die Bilderfassung unter dem SEM überwinden.
Floral meristems mit FAA fixiert (Formalin-Acetic-Alkohol) und mit dem kritischen Punkt Dryer (CPD) verarbeitet nicht Zellwände oder verzerrt Organe kollabiert Display. Diese Ergebnisse sind von entscheidender Bedeutung für die Rekonstruktion der Blütenentwicklung. Eine ähnliche CPD-basierte Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen, wie beispielsweise die mit Glutaraldehyd fixierten Oomyceten Zysten ist optimal die differentielle Wachstum von diagnostischen Eigenschaften zu testen (beispielsweise die Zyste Stacheln) auf verschiedenen Arten von substrates. Die Zerstörung der Nährzellen an Pilzsporen wurde nach Rehydrierung vermieden, Dehydrierung und der CPD-Behandlung, ein wichtiger Schritt für die weitere funktionelle Studien dieser Zellen.
Die Protokolle detailliert hier repräsentieren preiswerte und schnelle Alternativen für den Erwerb von qualitativ gute Bilder Wachstumsprozesse zu rekonstruieren und diagnostischen Eigenschaften zu studieren.
In der Biologie ist die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Untersuchungen von Strukturentwicklung erweitert, vergleichende Morphologie, Organentwicklung und Charakterisierung von Populationen oder 1 - Arten. Mit seiner zweidimensionalen Ansicht von mikroskopischen Strukturen, Bereiche wie Mikromorphologie und Systematik profitierte von SEM - Technik Fortschritte seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts. Beispielsweise hat die Einführung der Sputter - Beschichtungsmethode in den 1970er Jahren möglich , Beobachtungen von empfindlichen Materialien wie Spross Scheiteln und Blüten der Abbildungs aus nichtleitendem Geweb....
HINWEIS: Dieses Protokoll enthält sechs Hauptbereiche, drei gewidmet bestimmte Organismen (Abschnitte 1-3), und drei der Beschreibung der Verfahren, die für alle (4-6). Sternchen (*) zeigen Schritte, die von den Experimentatoren modifiziert.
1. Studium der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed
Floral Entwicklung und Fixierung der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed
Mit dem FAA-CPD-Protokoll hier beschrieben, junge und reife Pflanzengewebe optimal fixiert und dehydriert für SEM-Bildgebung. Prozesse wie Blütenentwicklung kann rekonstruiert werden , weil die Topographie und die Form der Knospen nicht durch Zellschrumpfungs (Figuren 1b, 1d, 4a-f) verzerrt. Strukturen mit komplizierten Formen k.......
In Bezug auf die Standard-SEM-Protokolle, präsentiert die Verfahren hier sind relativ schnell, einfach zu folgen, und Low-Cost-Methoden. Je nach der Menge der Proben und auf die Leichtigkeit der Verarbeitung, dauert es vier bis fünf Tage, um Bilder von guter Qualität erhalten. Einschließlich einer angemessenen Sicherheitsvorkehrungen für die CPD und SEM-Betrieb sind die Verfahren einfach zu handhaben. Besondere Vorsicht ist mit Formalin und Glutaraldehyd (siehe Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 und 2.1.5 des Protokolls) ent.......
Dieses Projekt hat die Finanzierung von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm unter Finanzhilfevereinbarung Nr erhielt 634429. Diese Publikation des Autors, die Ansichten reflektiert, und die Europäische Kommission kann nicht für die weitere Verwendung gehalten werden, die von den Informationen gemacht werden können, darin enthalten sind. Wir erkennen auch die finanzielle von Real Jardín Botánico, CSIC Beitrags. SR dankt der Europäischen Union [ITN-SAPRO-238550] für die Unterstützung ihrer Forschung in Saprolegnia. Wir wollen auch für bieten Francisco Calonge danken Sie bitte die Phellorinia herculanea Bilder und B....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
Double sided sellotape | No specific supplier | ||
Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
Filter paper | No specific supplier | ||
Forceps | No specific supplier | ||
Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
Glass cover slips | No specific supplier | ||
Glass hermetic container | No specific supplier | ||
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
needles | No specific supplier | ||
Petri dishes | No specific supplier | ||
Plastic containers | No specific supplier | ||
Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
scalpels | No specific supplier | ||
Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
Software for SEM | |||
Solution A: NaH2PO4 | |||
Solution B: Na2HPO4 | |||
Specimen holders | No specific supplier | ||
Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
Stereomicroscope | No specific supplier | ||
Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
Tweezers | No specific supplier |
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