問題のあるプラント、卵菌類、および真菌サンプルのための電子顕微鏡（SEM）プロトコルをスキャン

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

走査型電子顕微鏡（SEM）による観察のための生物学的サンプルの処理における一般的な問題は、細胞崩壊、湿式微環境からのサンプルを処理し、細胞の破壊を含みます。 SEM下の画像キャプチャのための試料処理における主な課題のいくつかを克服するため、ここで説明されているデリケートなサンプルを処理するために、特定のプロトコルを若い花の組織、卵菌類嚢胞、および例などの真菌胞子（ハラタケ目）を使用します。

花分裂組織FAA（ホルマリン酢酸 - アルコール）で固定し、臨界点乾燥機（CPD）で処理が崩壊セルラー壁や歪ん臓器が表示されませんでした。これらの結果は、花の開発の復興のために非常に重要です。このようなグルタルアルデヒド固定卵菌類嚢胞等の湿式微小環境からのサンプルの同様のCPDに基づく治療、suコマンドの異なる種類の診断特性（ 例えば、嚢胞棘）の差動成長をテストすることが最適ですbstrates。カビの胞子に取り付けられたナース細胞の破壊を再水和、脱水、及びCPD処理、これらの細胞のさらなる機能研究のための重要なステップの後に回避されました。

ここでの詳細なプロトコルは、成長プロセスを再構築し、診断特性を研究するために、良好な品質の画像を取得するための低コストで迅速な代替物を表します。

生物学では、走査型電子顕微鏡（SEM）の使用は、構造進化の研究、比較形態、器官の発達、及び集団又は種¹の特徴に拡張されています。微細構造体の、その2次元図では、このような微細形態や系統などの分野は、20 ^世紀後半以降のSEM技術の進歩から利益を得ました。例えば、1970年代にスパッタコーティング方法論の導入は、このような非導電性組織^2、3のイメージングを高める茎頂や花などの繊細な素材の可能な観察を行いました。 SEMは、高真空環境⁴の形状を再現するために、試料の表面から放出された電子を使用します。

SEMを含む研究は、構造的な文字の推論とgrowtの復興の両方に重点を置いています時間プロセス。広範囲の生物の分類と系統に関連する新しい構造的な文字は、SEM観察から発見されています。例えば、このような木材^_5、柱頭の多様性^6、蜜腺と花の形態^7、8の衣をまとったピットなどの種の診断またはsupraspecific分類ご....

注：このプロトコルは、すべての（4-6）に一般的な手順を記述した特定の生物（セクション1-3）、および三から三献身的な6つの主要なセクションが含まれています。アスタリスク（*）は、実験者によって変更された手順を示しています。

1.開発の研究と完全に形成されたプラントの構造

1. コレクションと固定
   1. 植物材料は、ドラフトチャンバー?.......

花の開発と開発の固定と完全に形成されたプラントの構造

ここで説明FAA-CPDのプロトコルを使用して、若い成熟した植物組織を最適に固定され、SEMイメージングのために脱水されています。芽の地形や形状が収縮細胞（ 図1B、1D、図4A-F）によって歪まされていないので、このような花の発達等の処理を再構成す?.......

標準的なSEMプロトコルに関しては、ここで紹介する手順は、比較的、迅速な追随しやすく、かつ低コストの方法論を含みます。試料の量と処理の容易さに応じて、良好な品質の画像を取得するために4〜5日かかります。 CPDとSEMの操作のための適切な安全措置を含め、手続きは、取り扱いが容易です。特に注意が（1.1.3およびプロトコルの2.1.5へのステップ1.1.1を参照）、ホルマリンやグルタル?.......

このプロジェクトは、このマニュアルでは、唯一の著者の見解を反映し、欧州委員会は、情報を挙げることができる任意の使用のための責任を負うことはできません付与契約番号634429.の下で、欧州連合（EU）のホライゾン2020年研究と技術革新プログラムから資金提供を受けていますその中に含まれます。我々はまた、レアルハルディンボタニコ、CSIC製の資金拠出を認めます。 SRはサプロレグニアで彼女の研究をサポートするため、欧州連合（EU）[ITN-SAPRO-238550]に感謝しています。我々はまた、親切Phelloriniaのherculanea画像を提供し、処理サンプルについてB.プエヨ（図5）のためのフランシスコカロンジュに感謝したいと思います。すべての画像はマドリードでレアルハルディンボタニコ-CSICのSEMサービスによって撮影されました。