Skanning elektronmikroskopi (SEM) Protokoller for Problema Plant, eggsporesopper, og Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Vanlige problemer i behandling av biologiske prøver for observasjoner med scanning elektronmikroskop (SEM) innbefatter at celler faller sammen, behandling av prøver fra våte microenvironments og celle-ødeleggelse. Ved hjelp av små blomster vev, eggsporesopper cyster, og sopp sporer (Agaricales) som eksempler, spesifikke protokoller for å behandle ømfintlige prøvene er beskrevet her at overvinne noen av de viktigste utfordringene i prøvebehandling for bildeopptak under SEM.

Blomster meristemer fast med FAA (Formalin-Acetic-alkohol) og behandlet med Critical Point Dryer (CPD) ble ikke vist kollapset mobile vegger eller forvrengt organer. Disse resultatene er avgjørende for gjenoppbyggingen av floral utvikling. En lignende CPD-basert behandling av prøver fra våte mikromiljøer, slik som glutaraldehyd-fiks eggsporesopper cyster, er optimal for å teste den differensielle vekst av diagnostiske egenskaper (f.eks, cysten pigger) på forskjellige typer substrates. Ødeleggelse av sykepleier celler knyttet til sopp sporer ble unngått etter utvanning, dehydrering, og CPD behandling, et viktig skritt for videre funksjonelle studier av disse cellene.

Protokollene beskrevet her representerer lav pris og raske alternativer for erverv av bilder av god kvalitet for å rekonstruere vekstprosesser og for å studere diagnostiske egenskaper.

I biologi, har bruken av scanning elektronmikroskopi (SEM) er utvidet til studier av strukturell utvikling, sammenlignende morfologi, organutvikling, og karakterisering av populasjoner eller arter ^1. Med sin to-dimensjonal visning av mikroskopiske strukturer, områder som micromorphology og systematikk profit SEM teknikk fremskritt siden andre halvdel av det ^20. århundre. For eksempel, innføring av frese belegget metodikken i 1970 gjort mulig observasjoner av ømfintlige materialer som skyter toppunktene og blomster som forsterker avbildning av ikke-ledende vev ^{2, 3.} SEM bruke....

MERK: Denne protokollen omfatter seks hoveddeler, tre viet til bestemte organismer (§§ 1-3), og tre som beskriver prosedyrer som er felles for alle (4-6). Stjerne (*) indikerer trinn modifisert av forskere.

1. Studier av Utvikling og fullt dannet anleggsstruktur

1. Innsamling og fiksering
   1. Dersom plantematerialet samles på et sted uten tilgang til et avtrekksskap, og innføre dyppe materialet i 70% etanol i sentrifugerør. Ideelt dyppe materialet etter 48 .......

Blomster Utvikling og Fiksering av Utvikling og fullt dannet anleggsstruktur

Bruke FAA-CPD-protokollen er beskrevet her, er unge og modne plantevev optimalt fast og dehydrert for SEM bildebehandling. Prosesser som blomsterutvikling kan rekonstrueres fordi topografi og formen av knopper ikke blir forvrengt av celle krymping (fig 1b, 1d, 4a-f). Strukturer med komplekse former kan med hell belagt med et jevnt lag a.......

Med hensyn til standard SEM protokoller, prosedyrer som presenteres her inkluderer relativt rask, lett å følge, og rimelige metoder. Avhengig av hvor mye prøver og på enkel behandling, tar det fire til fem dager for å hente bilder av god kvalitet. Inkludert tilstrekkelige sikkerhetsregler for CPD og SEM drift, prosedyrene er lett å håndtere. Spesiell forsiktighet bør tas med formalin og glutaraldehyd (se trinn 1.1.1 til 1.1.3 og 2.1.5 i protokollen). Det er visse skritt der, hvis det er nødvendig, kan prosessen.......

Dette prosjektet har fått støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram i tilskuddsavtalen No. 634429. Denne publikasjonen reflekterer bare synet til forfatteren, og EU-kommisjonen kan ikke holdes ansvarlig for bruk som kan gjøres av informasjonen inneholdt deri. Vi erkjenner også den økonomiske bidraget fra Real Jardín Botánico, CSIC. SR er takknemlig overfor EU [ITN-Sapro-238550] for støtte av sin forskning i Saprolegnia. Vi ønsker også å takke Francisco Calonge for bes gi Phellorinia herculanea bilder og B. Pueyo for behandling av prøvene (figur 5). Alle bildene ble tatt av SEM tjenesten på Real Jardín Botánico-CSIC i Madrid.