Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Os problemas mais comuns no processamento de amostras biológicas para observações ao microscópio eletrônico de varredura (MEV) incluem colapso das células, o tratamento de amostras de microambientes molhadas e destruição celular. Utilizando tecidos jovens florais, cistos oomicetos e esporos de fungos (Agaricales) como exemplos, protocolos específicos para processar amostras delicadas são descritos aqui que superar alguns dos principais desafios no tratamento da amostra para a captura de imagem sob o SEM.

meristemas florais fixos com FAA (formalina-acético-Álcool) e processados ​​com o Ponto Crítico Secador (CPD) não apresentaram colapso paredes celulares ou órgãos distorcidas. Estes resultados são cruciais para a reconstrução do desenvolvimento floral. Um tratamento à base de CPD semelhante de amostras de micro-ambientes molhados, tais como os cistos oomicetos fixadas com glutaraldeído, é ideal para testar o crescimento diferencial de características de diagnóstico (por exemplo, os espinhos de quisto) em diferentes tipos de substrates. A destruição das células ligadas a enfermeira esporos de fungos foi evitada após re-hidratação, desidratação, e o tratamento de CPD, um passo importante para mais estudos funcionais destas células.

Os protocolos detalhados aqui representam de baixo custo e alternativas rápidas para a aquisição de imagens de boa qualidade para reconstruir os processos de crescimento e estudar características de diagnóstico.

Na biologia, o uso de microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi estendido para estudos de evolução estrutural, a morfologia comparativa, o desenvolvimento de órgãos, e caracterização de populações ou espécies ^1. Com a sua visão bidimensional de estruturas microscópicas, áreas como a micromorfologia e sistemática lucrado com SEM técnica avanços desde a segunda metade do século ^20. Por exemplo, a introdução da metodologia de revestimento por pulverização na década de 1970 fez eventuais observações de materiais delicados, como ápices vegetativos e flores que reforcem a imagem de tecidos não condutores ^2,

NOTA: Este protocolo inclui seis seções principais, três dedicados a organismos específicos (secções 1-3), e três que descrevem os procedimentos comuns a todos (4-6). Asteriscos (*) indicam passos modificados pelos pesquisadores.

1. Estudos de Desenvolvimento e Estruturas Vegetais completamente formado

1. Recolha e fixação
   1. Se o material vegetal é coletado em um local sem acesso a uma câmara de exaustão, introduzir e imergir o material em 70% de e.......

Desenvolvimento Floral e Fixação de Desenvolvimento e Estruturas Vegetais completamente formado

Usando o protocolo FAA-CPD descrito aqui, jovens e maduros tecidos vegetais são perfeitamente fixadas e desidratadas para geração de imagens SEM. Processos tais como o desenvolvimento floral pode ser reconstruído, porque a topografia ea forma dos botões não é distorcida por celular encolhendo (Figuras 1b, 1d, 4a-f)........

No que diz respeito aos protocolos SEM padrão, os procedimentos aqui apresentados incluem relativamente rápida, fácil de seguir, e metodologias de baixo custo. Dependendo da quantidade de amostras e na facilidade de processamento, que leva quatro a cinco dias para adquirir imagens de boa qualidade. Incluindo as precauções de segurança adequadas para a CPD e operação SEM, os procedimentos são fáceis de manusear. Um cuidado especial deve ser tomado com formalina e o glutaraldeído (consulte os passos 1.1.1 a 1.1.......

Este projecto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção No. 634429. Esta publicação reflecte apenas as opiniões do autor, ea Comissão Europeia não pode ser responsabilizada por qualquer uso que possa ser dado à informação nele contidas. Nós também reconhecemos a contribuição financeira do real Jardín Botánico, CSIC. SR é grato à União Europeia [ITN-SAPRO-238550] pelo apoio de sua pesquisa em Saprolegnia. Também quero agradecer a Francisco Calonge por gentilmente fornecer as imagens herculanea Phellorinia e B. Pueyo para o processamento de amostras (Figura 5). Todas as i....