Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Vanliga problem i bearbetning av biologiska prover för observationer med svepelektronmikroskop (SEM) innefattar cellkollaps, behandling av prover från våta mikromiljöer och celldöd. Använda unga blommor vävnader, Algsvampar cystor och svampsporer (Agaricales) som exempel, specifika protokoll för att behandla känsliga prover beskrivs här som övervinner några av de största utmaningarna i provbehandling för bildtagning under SEM.
Blommor meristems fast med FAA (Formalin Ättiksyra-alkohol) och behandlas med den kritiska punkten Dryer (CPD) inte visa kollapsade cellväggar eller förvrängda organ. Dessa resultat är avgörande för återuppbyggnaden av blommor utveckling. En liknande CPD-baserad behandling av prover från våta mikromiljöer, såsom glutaraldehydfixerade Algsvampar cystor, är optimalt att testa differential tillväxten av diagnostiska egenskaperna (t.ex., cysta ryggar) på olika typer av SUbstrates. Förstörelse av sjuksköterska celler fästa till svampsporer undveks efter rehydrering, uttorkning, och CPD behandling, ett viktigt steg för ytterligare funktionella studier av dessa celler.
Protokollen som beskrivs här representerar låg kostnad och snabbt alternativ för förvärv av god kvalitet bilder att rekonstruera tillväxtprocesser och att studera diagnostiska egenskaper.
I biologi, har användningen av svepelektronmikroskopi (SEM) utsträckts till studier av strukturella utvecklingen, jämförande morfologi, organutveckling, och karakterisering av populationer eller arter 1. Med två-dimensionell bild av mikroskopiska strukturer, områden såsom Mikromorfologi och systematik dragit nytta SEM förskott teknik sedan andra halvan av 20-talet. Till exempel införandet av tronsputterbeläggningsmetod på 1970-talet gjorde möjliga observationer av ömtåliga material, såsom skott spetsar och blommor som ökar avbildning av icke-ledande vävnader 2, 3. SEM använd....
OBS: Detta protokoll omfattar sex huvudsektioner, tre ägnas åt specifika organismer (avsnitt 1-3), och tre som beskriver de förfaranden som är gemensamma för alla (4-6). Asterisker (*) indikerar steg modifierade av praktiker.
1. Studier av att utveckla och fullt utvecklade anläggningsstrukturer
Blommor utveckling och Fixering av att utveckla och färdigformade anläggningsstrukturer
Använda FAA-CPD protokoll som beskrivs här, är unga och mogna växtvävnader optimalt fasta och uttorkade för SEM avbildning. Processer såsom blommor utveckling kan rekonstrueras eftersom topografin och formen av knopparna inte snedvrids genom cell krymper (figurerna 1b, 1d, 4a-f). Strukturer med komplexa former kan fr.......
När det gäller vanliga SEM protokoll, de förfaranden som presenteras här omfattar relativt snabb, lätt att följa, och låg kostnad metoder. Beroende på mängden av prov och på den lättare bearbetning, det tar fyra till fem dagar för att få bilder av god kvalitet. Inklusive lämpliga säkerhetsåtgärder för CPD och SEM drift förfarandena är lätta att hantera. Särskild försiktighet bör iakttas med formalin och glutaraldehyd (se steg 1.1.1 till 1.1.3 och 2.1.5 i protokollet). Det finns vissa steg där, o.......
Detta projekt har fått stöd från EU: s Horisont 2020 forsknings- och innovationsprogram enligt bidragsavtal nr 634429. Denna publikation ansvarar endast upphovsmannen, och kommissionen kan inte hållas ansvarig för någon användning som kan göras av informationen som finns däri. Vi erkänner också det finansiella bidraget från Real Jardín Botánico, CSIC. SR är tacksam mot Europeiska unionen [ITN-Sapro-238.550] för att stödja sin forskning i Saprolegnia. Vi vill också tacka Francisco Calonge för vänligt ge phellorinia herculanea bilder och B. Pueyo för bearbetning prover (Figur 5). Alla bilder är tagna av SEM tjänsten på Real Jardín Botánico-CSIC i Madr....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
Double sided sellotape | No specific supplier | ||
Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
Filter paper | No specific supplier | ||
Forceps | No specific supplier | ||
Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
Glass cover slips | No specific supplier | ||
Glass hermetic container | No specific supplier | ||
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
needles | No specific supplier | ||
Petri dishes | No specific supplier | ||
Plastic containers | No specific supplier | ||
Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
scalpels | No specific supplier | ||
Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
Software for SEM | |||
Solution A: NaH2PO4 | |||
Solution B: Na2HPO4 | |||
Specimen holders | No specific supplier | ||
Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
Stereomicroscope | No specific supplier | ||
Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
Tweezers | No specific supplier |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved