Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Published: February 3rd, 2017

DOI:

10.3791/55031

M. Angélica Bello¹, Yolanda Ruiz-León², J. Vladimir Sandoval-Sierra³, Svetlana Rezinciuc⁴, Javier Diéguez-Uribeondo³

¹Biodiversity and Conservation Department, Real Jardín Botánico, CSIC, ²Research Support Unit, Real Jardín Botánico, CSIC, ³Mycology Department, Real Jardín Botánico, CSIC, ⁴Division of Glycoscience, AlbaNova University Center, Royal Institute of Technology (KTH)

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile gözlemler için biyolojik numunelerin işlem en sık karşılaşılan sorunlardır hücre çökme ıslak mikroçevrelerde ve hücre tahrip örnekler işlemden geçirilmesini içerir. SEM altında fotoğraf çekimi için örnek tedavisinde başlıca zorluklardan bazıları üstesinden burada açıklanmıştır narin örnekleri işlemek için, belirli protokoller genç çiçek dokuları, oomiset kistler ve örnek olarak mantar sporları (Agaricales) kullanma.

FAA ile tespit Çiçek meristemler (Formalin-Alkol-Asetik) ve Kritik Nokta Kurutma (CPD) ile işlenmiş hücresel duvarlar ya da bozuk organları çöktü göstermezse vermedi. Bu sonuçlar çiçek gelişiminin yeniden inşası için büyük önem taşımaktadır. Böyle glutaraldehit sabit oomiset kistleri gibi ıslak mikroçevrelerde, alınan örneklerin benzer bir CPD-temelli tedavi, su farklı türde tanısal özelliklerini diferansiyel büyümesini (örneğin, kist dikenleri) test etmek en uygunudurbstrates. mantar sporları bağlı hemşire hücrelerinin imha rehidrasyon, dehidratasyon ve CPD tedavisi, bu hücrelerin daha fonksiyonel çalışmalar için önemli bir adım sonra kaçınıldı.

Burada ayrıntılı protokoller düşük maliyetli ve büyüme süreçlerini yeniden ve tanı özelliklerini incelemek için iyi kalitede görüntüler elde edilmesi için hızlı alternatifleri temsil etmektedir.

Biyolojide, taramalı elektron mikroskobu kullanımı (SEM) yapısal evrimi, karşılaştırmalı morfoloji, organ gelişimi ve nüfus veya türlerin ¹ karakterizasyonu çalışmalarına uzatıldı. Mikroskobik yapılar olan iki boyutlu görüntüsü, böyle bir mikromorffolojisinin ve sistematiği olarak alanlar 20. ^yüzyılın ikinci yarısından itibaren SEM tekniği avans yararlandı. Örneğin, 1970'lerde püskürtmeli kaplama yönteminin tanıtımı olarak iletken olmayan dokularda ^{^2,} ³ görüntüleme yükseltmiş gibi sürgün uçları ve çiçekler gibi hassas malzemelerin olası gözlemler yapılmıştır. SEM yüksek ....

NOT: Bu protokol, tüm (4-6) ortak prosedürler açıklayan belirli organizmaların (bölümler 1-3), ve üç üç adamış altı ana bölümden içerir. Yıldız (*) denemecileri modifiye adımları göstermektedir.

1. Gelişmekte Olan Araştırmalar ve Tam kurulan Bitki Yapıları

Toplama ve sabitleme
1. bitki materyali bir çeker ocak erişimi olmayan bir yerde toplanması halinde, tanıtmak ve santrifüj tüplerine% 70 etanol içinde malzemeyi batırmay?.......

Çiçek Gelişim ve Geliştirme Fiksasyon ve Tam kurulan Bitki Yapıları

Burada anlatılan FAA-CPD protokolü kullanarak, genç ve olgun bitki dokuları optimal sabit ve SEM görüntüleme için susuz vardır. Tomurcuklarının topografya ve şekli küçülen hücre (Şekil 1b, 1d, 4a-f) tarafından deforme olmaz çünkü bu tür çiçek gelişme olarak Süreçler yeniden inşa edilebilir. Karmaşık şekilli y.......

Standart SEM protokollere göre, burada sunulan prosedürler nispeten hızlı takip edilmesi kolay ve düşük maliyetli metodolojileri içerir. Numunelerin miktarı ve işleme kolaylığı bağlı olarak, kaliteli görüntüler elde etmek için dört-beş gün sürer. CPD ve SEM çalışması için yeterli güvenlik önlemleri de dahil olmak üzere, prosedürler ele kolaydır. Özellikle dikkat (1.1.3 ve protokolün 2.1.5 adımları 1.1.1 bakınız) formalin ve glutaraldehid ile alınmalıdır. Örnekleri zarar veya ö.......

Bu proje hibe sözleşmesi No. Bu yayın sadece yazarın görüşlerini yansıtmaktadır 634429. kapsamında Avrupa Birliği Ufku 2020 araştırma ve yenilik programı fon aldı ve Avrupa Komisyonu bilgilerin herhangi bir şekilde kullanımından sorumlu tutulamaz burada yer alan. Biz de gerçek Jardín Botánico, CSIC tarafından yapılan mali katkı kabul. SR Saprolegnia onun araştırma desteği için Avrupa Birliği [ITN-SAPRO-238550] minnettardır. Biz de nazik için Francisco Calonge teşekkür numuneleri (Şekil 5) işlemek için Phellorinia Herculanea görüntüleri ve B. Pueyo sağlamak istiyoruz. Tüm görüntüler Madrid Real Jardín Botánico-CSIC SEM hizmeti tarafından alınmıştır. ....

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	No specific supplier		Skin irritation, eye irritation
aluminium stubs	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Centrifuge tubes	No specific supplier
Critical Point Dryer	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D (+) Glucose	Merck	1,083,421,000
Double sided sellotape	No specific supplier
Ethanol absolute	No specific supplier.		Flammable
European bacteriological agar	Conda	1800.00	www.condalab.com
Filter paper	No specific supplier
Forceps	No specific supplier
Formalin 4%	No specific supplier.		Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slips	No specific supplier
Glass hermetic container	No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L)	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Mycological peptone	Conda	1922.00	www.condalab.com
needles	No specific supplier
Petri dishes	No specific supplier
Plastic containers	No specific supplier
Sample holder with lid for the critical point dryer	Ted Pella, Inc.	4591	www.tedpella.com
scalpels	No specific supplier
Scanning Electron Microscope	Hitachi	S3000N
Software for SEM
Solution A: NaH₂PO₄
Solution B: Na₂HPO₄
Specimen holders	No specific supplier
Sputter coater	Balzers	SCD 004
Stereomicroscope	No specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) grids	Electron Microscopy Sciences	G200 (Square Mesh)	www.emsdiassum.com
Tweezers	No specific supplier

Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi&#34. Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
Echlin, P. . Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
Rezinciuc, S. . The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , (2013).